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肾癌,又称肾细胞癌,在泌尿系统恶性肿瘤中发病率仅次于膀胱癌。虽然目前对肾癌发病机制的分子生物学方面的研究取得了很大进步,但现行的临床化疗方案和昂贵的靶向治疗仍存在较大毒副作用及多药耐药的问题,所以目前的治疗手段是很有限的。近期研究报道Notch信号通路是调控肾细胞癌肿瘤生长的重要靶点,而PI3K/Akt信号通路是恶性肿瘤细胞凋亡的关键靶点。团队前期研究发现,软坚散结胶囊具有抑制动物肿瘤细胞生长的作用,故本课题拟在此基础上围绕软坚散结胶囊对Notch这个肾细胞癌新靶点和PI3K/Akt经典肿瘤细胞凋亡通路各发挥了什么样的作用,其内在关联和机制是怎样的等科学问题,在分子水平探讨Notch与PI3K/Akt这种相互作用是否可以调控肾癌细胞的凋亡,从而控制肾肿瘤的生长。目的：本实验初步探讨了软坚散结胶囊含药血清及穿山甲蛋白提取物对人肾透明细胞癌7860细胞增殖及凋亡的影响,从分子生物学角度研究,软坚散结胶囊含药血清及穿山甲蛋白提取物通过调控Notch和PI3K/Akt信号通路促进肿瘤细胞凋亡,且Notch和PI3K/Akt信号通路相互作用共同抑制肿瘤细胞生长的作用机制。方法：实验共分为四部分：①以软坚散结胶囊饲养大鼠7天后获得含药血清,用CCK8法观察不同剂量含药血清对人肾透明细胞癌7860和人肾近球小管上皮细胞HKC作用24h、48h、72h后,抑制细胞增殖的作用；用流式细胞术检测不同剂量含药血清作用7860、HKC细胞48h后,对其凋亡及周期的影响；激光共聚焦显微镜观察含药血清作用48h后的经AnnexinV-FITC/PI双染的7860细胞的凋亡形态。②软坚散结胶囊不同剂量含药血清作用7860细胞48h后,Western blot和RT-PCR检测Notchl、NICD、Akt、p-Akt、Bc1-2、Bax蛋白及相关mRNA的变化；通过激光共聚焦显微镜观察Bc1-2、Bax蛋白活化后荧光强度及核位移的变化。③分别阻滞Notch和PI3K/Akt信号通路后,Western blot和RT-PCR检测Notchl、NICD、Akt、p-Akt、Bc1-2、Bax蛋白及mRNA的变化及流式细胞术检测对7860细胞凋亡的影响。④不同浓度穿山甲蛋白提取物作用7860细胞24h、48h、72h后,CCK8法观察对细胞增殖的抑制作用；不同浓度穿山甲蛋白提取物作用7860细胞48h后,流式细胞术检测对细胞凋亡的影响,激光共聚焦显微镜观察经AnnexinV-FITC/PI双染法的7860细胞凋亡形态；穿山甲蛋白提取物作用7860细胞48h后,Western blot和RT-PCR检测Notch1、 NICD、Akt、p-Akt、Bcl-2、 Bax蛋白及mRNA的变化,并通过激光共聚焦显微镜观察Bcl-2、Bax蛋白活化后荧光强度及核位移的变化。结果：(一) 实验一1.用CCK8法检测细胞增殖活力,软坚散结胶囊各剂量浓度含药血清作用于肾透明细胞癌7860细胞24、48、72小时后各剂量组均可抑制7860细胞的增殖。2.流式细胞术检测细胞凋亡率,软坚散结胶囊各剂量浓度含药血清作用7860细胞48h后,中、高剂量组细胞凋亡率较阴性对照组均明显增高(P<0.05)。3.流式细胞术检测细胞周期,软坚散结胶囊各剂量浓度含药血清作用7860细胞48h后,各剂量组细胞G0/G1期细胞比例较阴性对照组显著增加(P<0.05),提示软坚散结胶囊将肿瘤细胞分化明显阻滞于G0/G1期。4.激光共聚焦显微镜观察,软坚散结胶囊含药血清作用48h后的细胞,与阴性对照组相比FITC和PI均明显高染,各剂量浓度组出现不同数量的早、中、晚期凋亡细胞,且具有典型的细胞凋亡形态。5.软坚散结胶囊各剂量浓度含药血清作用人肾近球小管上皮细胞系HKC细胞后不能抑制其增殖及诱导细胞凋亡。(二) 实验二1.软坚散结胶囊各剂量浓度含药血清及榄香烯注射液对7860细胞作用48h后均可明显下调Notchl和Akt基因mRNA的表达水平(P<0.05)2.软坚散结胶囊各剂量浓度含药血清及榄香烯注射液对7860细胞作用48h后均可明显降低Notchl、NICD、p-Akt、Akt蛋白的表达水平(P<0.05)。3.软坚散结胶囊各剂量浓度含药血清及榄香烯注射液对7860细胞作用48h后均可明显降低Bcl-2基因mRNA的表达水平(P<0.05),而对Bax基因的调控,各含药血清和榄香烯组较阴性对照组明显升高(P<0.05)。4.软坚散结胶囊各剂量浓度含药血清及榄香烯注射液对7860细胞作用48h后可明显降低Bcl-2蛋白表达水平(P<0.05),可明显升高Bax蛋白表达水平(P<0.05)。5.运用激光共聚焦显微镜检测软坚散结胶囊各剂量浓度含药血清和榄香烯注射液对7860细胞作用48h后,随剂量浓度增加,发现Bcl-2蛋白免疫荧光强度逐渐减弱,Bax蛋白荧光逐渐增强,且出现不同程度入核。(三) 实验三1.转染Notchl siRNA或经Notch通路阻滞剂DAPT与软坚散结胶囊含药血清对7860细胞共作用48h后,较单用含药血清p-Akt蛋白表达水平明显下降(P<0.05)。2.转染Akt siRNA或经PI3K/Akt通路阻滞剂LY294002与软坚散结胶囊含药血清对7860细胞共作用48h后,较单用含药血清NICD蛋白表达水平明显下降(P<0.05)3.转染Notchl siRNA、Akt siRNA或经DAPT、LY294002与软坚散结胶囊含药血清对7860细胞共作用48h后,较单用含药血清细胞凋亡明显增多。(四) 实验四1.CCK8检测细胞增殖活力,穿山甲蛋白提取液和榄香烯注射液抑制人肾透明细胞癌7860细胞的增殖具有明显的时间-剂量依赖性。2.流式细胞术检测细胞凋亡率,不同浓度穿山甲蛋白提取物和榄香烯注射液对7860细胞作用48h后,凋亡率较空白对照组明显增高(P<0.05)。3.应用激光共聚焦显微镜观察,随穿山甲和榄香烯药物浓度的增加,红、绿色荧光逐渐增多,且出现细胞凋亡形态的变化。4.穿山甲蛋白提取物及榄香烯注射液可明显下调7860细胞Notchl、Akt、 Bcl-2基因mRNA的表达水平。5.穿山甲蛋白提取物及榄香烯注射液对7860细胞作用48h后均可明显降低Notch1、NICD、p-Akt、Akt、Bc1-2蛋白的表达水平,可明显升高Bax蛋白表达水平。6.运用激光共聚焦显微镜观察发现穿山甲蛋白提取液和榄香烯注射液可使Bcl-2蛋白免疫荧光减弱,Bax蛋白免疫荧光增强。结论：1.软坚散结胶囊含药血清可抑制人肾透明细胞癌7860细胞增殖,诱导7860细胞凋亡增多,细胞分化周期阻滞在G0/G1期。2.软坚散结胶囊含药血清可通过抑制7860细胞Notch和PI3K/Akt信号通路,调控Bc1-2、Bax蛋白和基因的表达,从而促进细胞凋亡。3.阻滞Notch信号通路可下调p-Akt蛋白表达水平,阻滞PI3K/Akt信号通路可抑制NICD蛋白的表达,且阻滞Notch或PI3K/Akt信号通路均可促进细胞凋亡。4.Notch信号通路和PI3K/Akt信号通路可相互激活。5.穿山甲蛋白提取物和榄香烯注射液均可抑制人肾透明细胞癌7860细胞增殖,诱导凋亡率增加,并可抑制Notch和PI3K/Akt信号通路的活性,调控Bcl-2和Bax蛋白和基因的表达,促进肿瘤细胞凋亡。