细菌和病毒均可造成不明原因肺炎,许多新发传染病也常常引起不明原因肺炎。因此,对不明原因肺炎病原的准确鉴定和特征分析对临床治疗和公共卫生都具有重要意义。然而,尽管检测技术不断进步,目前对于不明原因肺炎的病原认识依然有限。宏基因组学方法可对病例临床样本中所有微生物进行基于序列的分析,相比传统的Real-time PCR等方法,宏基因组学方法无需预知病原的背景信息,能对临床样本中所有微生物进行全面检测,同时获得病原的基因组信息,非常适合不明原因肺炎病原研究。近年来,下一代测序技术(Next generation sequencing, NGS)取得了巨大进展,极大的提高了宏基因组学在临床上应用。但使用宏基因组学进行不明原因肺炎病原研究,常常会遇到核酸的偏好性扩增、宿主基因组成分比例过高以及数据分析困难等各种挑战。本研究通过对临床样本进行低速离心和过滤去除宿主细胞组分,核酸酶消化去除外源性核酸等方法,极大的降低了NGS测序数据中宿主基因组成分。在微量核酸扩增方法的选择上,我们评估了多重置换扩增(Multiple displacement amplification, MDA)和单引物等温扩增(Single primer isothermal amplification, SPIA)对呼吸道病原鉴定的能力,结果显示SPIA扩增均一性和病原检测能力均优于MDA,可将其作为随后病原鉴定的扩增方法。我们将建立的这套基于NGS的宏基因组学病原检测方法用于33份2013-2014年贵州省排除了流感和SARS病毒后的不明原因肺炎病例病原研究,经过样本预处理和SPIA扩增,利用Ion Torrent和Illumina MiSeq两个平台进行RNA-Seq二代测序。经过宏基因组学分析,在16份样本中检测出了13种病毒,其中鼻病毒C的比例最高。而且宏基因组学方法还可以获得病毒的全基因组序列信息进行进一步的进化和序列分析。对于RNA-Seq未能检测到呼吸道病原的17份样本,我们提取了样本DNA直接进行二代测序和宏基因组学分析。DNA-Seq未能在这些样本中发现DNA病毒,但微生物菌群分析显示,在这些患者的上呼吸道中分布着很高比例的Streptococcus 。而在Streptococcus中,机会病原菌SStreptococcus pneumonia的比例最高。不明原因肺炎病例往往经过抗生素治疗而无效。本研究将DNA-Seq结果与微生物耐药性数据库进行比对,发现绝大部分不明原因肺炎患者的上呼吸道细菌中,均携带有大量的耐药性基因,其中针对抗生素Beta-lactam, Tetracycline和Macrolide的耐药性基因数目最多。这些耐药性基因广泛分布在多个细菌分类群中,而其中Bacteroidales, Lactobacillales, Pseudomonadales是主要的耐药基因来源宿主菌。在部分样本中,Streptococcus和A.baumannii的比例很高,而这些细菌中耐药性基因比例同样很高,暗示细菌的耐药性基因丰度可能与该细菌的菌群丰度呈现一定的相关关系,或许可以作为临床治疗的靶点。综上所述,本研究建立了基于NGS的宏基因组学病原检测和特征分析技术平台。利用该平台,我们对收集到的贵州省2013～2014年的不明原因肺炎样本进行了RNA-Seq深度测序。结果显示鼻病毒C是不明原因肺炎病例最常见的病毒性病原。对RNA-Seq呼吸道病毒阴性的样本进行DNA-Seq,结果显示部分不明原因肺炎患者样本中含有很高比例的机会病原菌,且存在大量的耐药性基因。机会病原菌携带的耐药性基因比例与这些细菌在样本中比例呈现一定的相关关系,说明这些机会病原菌携带的耐药性基因可能造成了这些细菌在不明原因肺炎病例中的超量增值,并可能作为未来临床治疗的靶点。这些结果提供了不明原因肺炎患者的上呼吸道的病毒组、细菌组和耐药组的初步信息,为今后不明原因肺炎患者的病原鉴定和特征分析提供了技术平台。