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研究背景和目的破骨细胞抑制凝集素相关蛋白2(OCILRP2)属于C型凝集素相关(Clr)分子家族,选择性表达在淋巴组织、活化的淋巴细胞和树突状细胞(DC),其配体NKRP1f也可以表达在活化的淋巴细胞和DC,而且在DC的表达是淋巴细胞的上百倍。研究发现在T细胞活化过程中,OCILRP2通过结合配体NKRP1f可以协同B7与CD28的相互作用,促进T细胞的增殖与IL-2的产生,阻断OCILRP2受体信号可以抑制T淋巴细胞对抗原刺激的反应。虽然OCILRP2在DC中高表达,但有关OCILRP2在DC发育分化及功能中的作用目前还没有相关报道。DC作为体内唯一能够激活初始T淋巴细胞的抗原递呈细胞(APC),在连接固有免疫和适应性免疫中起桥梁作用。DC的模式识别受体(PRR)通过识别病原相关分子模式(PAMP)或应激细胞产生的危险信号诱导DC成熟和启动免疫应答。Toll样受体(TLR)是DC重要的PRR,通过识别特定的PAMP可以有效地诱导DC成熟和免疫应答的发生,但是TLR活化信号同时还受到DC中其他众多PRR信号的调节,有关OCILRP2信号在DC中对TLR信号通路的调节目前也还没有相关研究被报道。为此,我们将通过研究OCILRP2信号在DC发育分化以及功能中的作用,探讨OCILRP2信号调节LPS诱导的DC发育及功能性分化的机制,这将有助于指导DC疫苗的开发和应用于临床肿瘤及自身免疫性疾病的治疗。方法将表达OCILRP2胞外段和人IgG1Fc段融合蛋白的pIg-CD5-OCILRP2载体转染CHO细胞,G418筛选建立稳定表达细胞株。大量培养稳定表达细胞株,收集培养上清,Protein A亲和层析纯化OCILRP2-Fc蛋白；应用OCILRP2-Fc免疫家兔,制备兔抗血清,硫酸铵沉淀和protein G亲和层析纯化OCILRP2多克隆抗体。分离获取Balb/c小鼠(6-8周龄)骨髓细胞,采用重组的小鼠GM-CSF和IL-4诱导DC产生,LPS(500ng/ml)刺激细胞24h诱导DC成熟,在培养基中加入OCILRP2-Fc或OCILRP2抗体阻断OCILRP2信号在DC发育分化中的作用。流式细胞仪检测细胞表面标志分子CDllc、MHC-II、CD80和CD86在不成熟DC和成熟DC的表达,分析OCILRP2-Fc对DC发育分化的影响；流式细胞仪检测DC对FITC标记的Dextran的吞噬情况,分析OCILRP2-Fc对DC抗原吞噬能力的影响；混合淋巴细胞反应检测T淋巴细胞增殖,分析OCILRP2-Fc对DC激活T细胞能力的影响；ELISA和RT-PCR分别检测LPS刺激DC后培养上清中的细胞因子浓度和细胞中细胞因子的mRNA水平,分析OCILRP2-Fc和OCILRP2抗体对DC分泌细胞因子的影响；EMSA检测NF-κB的活化以及western blot检测I-κB的降解,探讨OCILRP2信号影响DC发育及功能的机制。Balb/c小鼠腹腔注射20mg/kg体重的LPS,实验组提前2h预先注射5mg/kg体重的OCILRP2抗体。通过观察记录小鼠的存活率,解剖小鼠称量脾脏大小,并将肺脏组织进行HE染色,分析OCILRP2抗体对小鼠存活以及对小鼠免疫反应的影响。结果建立了OCILRP2-Fc融合蛋白稳定表达细胞株,其目的蛋白表达水平可以达到>10mg/L,该细胞株经多次传代能够维持稳定的目的蛋白表达水平。将通过Protein A亲和层析纯化获得的OCILRP2-Fc进行SDS-PAGE电泳可见一分子量为～55kDa的蛋白条带,Western blot检测发现其可与山羊抗人IgG抗体结合。ELISA和Western blot检测纯化后的OCILRP2多克隆抗体,结果表明该抗体可以与OCILRP2-Fc和细胞裂解液中的OCILRP2发生特异性结合。LPS结合ELISA的结果显示LPS不能和OCILRP2-Fc相结合,说明LPS不是OCILRP2的配体。OCILRP2在LPS诱导的成熟DC的表达高于不成熟DC说明TLR4活化信号可以上调OCILRP2的表达。OCILRP2-Fc阻断OCILRP2受体信号后细胞表面标志分子CD11c、MHC-Ⅱ、CD80和CD86在不成熟DC及LPS诱导的成熟DC的表达均明显下调说明OCILRP2-Fc抑制了骨髓前体细胞向未成熟DC分化和抑制DC发育成熟。OCILRP2-Fc处理组DC的抗原吞噬能力和对T细胞的刺激能力降低,以及OCILRP2-Fc处理组DC培养上清中炎性细胞因子IL-6、IL-12、TNF-α等的表达水平降低,说明OCILRP2-Fc抑制了DC的功能。随着OCILRP2-Fc浓度的提高DC培养上清中IL-12的分泌水平越低,说明这种抑制作用具有剂量依赖性。OCILRP2多克隆抗体与OCILRP2-Fc在抑制DC炎性细胞因子表达中具有相同的效应,说明二者都可以通过阻断OCILRP2受体信号发挥作用。OCILRP2-Fc处理组与对照组DC培养上清中细胞因子IL-10的分泌没有差异,说明OCILRP2-Fc对DC的抑制作用不是通过IL-10发挥作用。western blot结果显示OCILRP2-Fc处理组DC中I-κB的降解减少,EMSA结果提示OCILRP2-Fc处理组DC中NF-κB的活化减少,说明OCILRP2-Fc通过影响NF-κB的活化发挥对DC的抑制作用。注射LPS72h后,OCILRP2抗体组小鼠的存活率为71.4%,PBS对照组小鼠全部死亡；OCILRP2抗体组小鼠的脾脏(0.07±0.028g)明显小于PBS对照组(0.12±0.026g)(p<0.05)；且OCILRP2抗体组肺脏组织中的炎症细胞浸润和血管的充血扩张的程度较对照组轻,说明OCILRP2抗体可以减轻LPS诱导的炎症反应和增加感染性休克小鼠的存活率。结论1)OCILRP2受体信号通过促进NF-κB的活化协同TLR4活化诱导的DC成熟及功能性分化；2)OCILRP2可以作为潜在的靶点应用于免疫性疾病的治疗。