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多花黑麦草(Lolium multiflorum Lamk.)隶属禾本科黑麦草属,具有刈割后再生能力强、生长速度快、产量高等优点。作为典型的冷季型牧草和草坪草,高温胁迫是限制多花黑麦草生长发育的关键因素。而我国长江中下游地区夏季温度高,持续时间久,严重影响多花黑麦草的牧草及草坪质量导致其死亡。因此,探究多花黑麦草应答高温胁迫的分子机理,提高多花黑麦草的耐热性,是当务之急。热激转录因子(Heat shock transcription factor,Hsf)是近年来发现的一类重要的高温响应转录因子,高温条件下能够激活下游耐热基因的表达,在植物响应耐高温胁迫中起着至关重要的作用。因此,本研究首先分析了黑麦草Hsf家族的基本理化性质以及系统进化关系,各Hsf成员在高温和干旱胁迫条件下的表达模式,进一步克隆了三个受高温和干旱显著诱导的LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5基因,并通过异源转化拟南芥以及水稻探究其耐高温胁迫的功能。主要研究内容及结果如下:1、根据多年生黑麦草基因组数据注释的基因信息对黑麦草Hsf基因进行非冗余筛选,最终从黑麦草基因组中共鉴定到16个Hsf基因家族成员。对各Hsf蛋白序列结构分析比较后,16个LpHsfs被分为A、B、C三类,其中A类成员最多,有8个,其次是B类,有5个,C类最少,只有3个。2、分别对多花黑麦草耐热品种‘邦德’进行38℃高温和干旱处理,发现LmHsfA2、LmHsfA4、LmHsfA5和LmHsfB2显著受高温诱导且在1 h时表达量最高;LmHsfA2、LmHsfA4、LmHsfA5、LmHsfA8、LmHsfB1、LmHsfB2和LmHsfC3均是随着干旱时间的延长表达量不断增加。我们结合两种胁迫条件下的表达模式和前人研究,最终选取LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5基因进行耐高温功能分析。3、以‘邦德’的混合cDNA为模板,克隆了LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5基因,其ORF分别包含1212、1659和1215个核苷酸。随后,构建融合表达载体pBI121-GFP-LmHsfA2、pBI121-GFP-LmHsfA4和pBI121-GFP-LmHsfA5,发现LmHsfA2和LmHsfA4蛋白定位于细胞核中,LmHsfA5则定位于细胞核和细胞膜。4、构建过表达载体pCAMBIA1301-LmHsfA2、pCAMBIA1301-LmHsfA4和pCAMBIA1301-LmHsfA5,每个基因选取两个表达高的转基因株系进行耐热表型分析。对5天苗龄的WT、Vector-control和过表达拟南芥株系进行46℃热激60 min,22℃恢复4天,发现LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5过表达株系的存活率显著高于WT和Vector-control。说明异源过表达LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5提高了拟南芥的耐高温能力。同时,对3周龄的WT、Vectorcontrol和过表达株系进行高温处理,发现处理后LmHsfA2和LmHsfA4过表达株系的萎蔫叶片数目显著低于对照,说明过表达LmHsfA2和LmHsfA4提高了转基因拟南芥成苗的耐热性;而过表达LmHsfA5植株与WT相比无明显差异。此外,在含300 mM甘露醇的1/2 MS培养基上,LmHsfA2和LmHsfA5过表达植株在萌发初期的萌发率显著高于对照WT和Vector-control。这说明过表达LmHsfA2和LmHsfA5也能增强转基因植株的干旱耐受性。5、为了进一步探究LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5在多花黑麦草耐热机制中的调控网络,利用qRT-PCR检测了35S::LmHsfA2、35S::LmHsfA4和35S::LmHsfA5过表达植株中热响应基因Hsp101,Hsp90,Hsp70,Hsp18.2,Hsp25.3,GOS1和HSFA2的表达情况,发现正常条件下LmHsfA2过表达株系中Hsp101、Hsp70和Hsp18.2的表达量显著高于野生型;LmHsfA4株系中Hsp101的表达量显著高于野生型;Hsp101、Hsp70、Hsp18.2和GOSL1的表达量在LmHsfA5转基因植株中显著高于WT,且热处理0.5 h后上述7个基因在LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5转基因植株及野生型中的表达水平均上调。这些结果说明Hsp101、Hsp70和Hsp18.2可能是LmHsfA2的靶基因,Hsp101可能是LmHsfA4的靶基因,Hsp101、Hsp70、Hsp18.2和GOSL1可能是LmHsfA5的下游靶基因,暗示LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5可能通过调控以上不同的下游基因来提高植株耐热性。6、在异源转化水稻实验中,目前已成功构建了PHGW-35S-LmHsfA2-4HA、PHGW-35SLmHsfA4-4HA和PHGW-35S-LmHsfA5-4HA融合表达载体;通过愈伤诱导、继代、筛选、分化和生根等步骤,已获得LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5T0代转基因水稻植株。综上所述,本研究筛选到了3个受高温干旱显著诱导的LmHsfs,通过异源转化模式植物拟南芥,发现过表达LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5提高了拟南芥的耐高温能力。随后通过检测过表达植株中热响应基因的表达情况初步推测LmHsfA2、LmHsfA4和LmHsfA5可能通过调控不同的下游靶基因来提高植株的耐热性。本研究为解析黑麦草的耐热分子机制奠定了基础,有望通过基因编辑丰富多花黑麦草的遗传资源,解决多花黑麦草在高温地区的推广问题,研究结果具有重要的理论和应用价值。