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肺癌是我国发病率和死亡率均最高的恶性肿瘤。非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)约占肺癌的80%-85%,目前主要治疗手段包括手术治疗、化学治疗、放射治疗及靶向治疗。尽管治疗方式众多,肺癌的5年生存率仍不足17%,多数病人最终死于远处转移。研究NSCLC发生发展的分子机制将有助于找寻更好的治疗靶点,从而设计更好的靶向治疗药物。表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor, EGFR)是1型酪氨酸激酶ErbB家族成员之一,该家族成员还包括ErbB2/Her2、Her3和Her4。EGFR的过表达及异常活化参与多种上皮恶性肿瘤的发生发展过程,NSCLC中亦常出现EGFR过表达或是酪氨酸激酶的活化突变。早在1983年就有学者提出针对EGFR的靶向治疗,目前靶向EGFR的治疗已经成功应用于临床,其主要方式有两种：一是针对EGFR的单克隆抗体,如西妥昔单抗；一是针对EGFR酪氨酸激酶活化突变的抑制剂(Tyrosine Kinase Inhibitors, TKIs),如吉非替尼、厄洛替尼等。尽管单克隆抗体和TKIs(特别是TKIs)在部分NSCLC病人中疗效显著,但几乎所有病人最终出现耐药。如何解决EGFR靶向治疗的原发性及继发性耐药问题仍是靶向治疗中的难题。microRNAs (miRNAs)是一类非编码的小分子RNA,长度约在22个核苷酸左右。miRNAs普遍存在于动植物细胞内,是基因表达和调控的转录后修饰途径,主要通过作用于靶基因mRNA的3’UTR端而发挥调节作用。据估计,哺乳动物中有超过50%的基因受miRNAs的调控。niRNAs参与细胞生命过程中几乎所有的重要进程,包括细胞增殖与分化、细胞周期调控、细胞死亡与凋亡、细胞迁移和侵袭等。miRNAs表达失调参与多种疾病包括肿瘤的发生与发展,几乎所有肿瘤中均能检测到miRNAs的异常表达,这些异常表达的miRNAs在肿瘤中发挥着癌基因或是抑癌基因的作用。近来研究显示,基于miRNAs的靶向治疗可能是一种有效可行的靶向EGFR的治疗手段。目前已知多种miRNAs(如miRNA-7, miRNA-23b/27b和]niRNA-133a等)能直接靶向EGFR,然而,更多靶向EGFR的miRNAs有待发现。本研究首先通过靶基因预测软件找寻可能直接靶向EGFR的miRNAs,并从保守的miRNAs中挑选了mirSVR评分靠前的3个miRNAs,在NSCLC细胞系中进行进一步验证,新发现一个能直接靶向EGFR的miRNA, miRNA-134(miR-134)；随后对miR-134在NSCLC中的抑癌作用及其机制进行了深入研究,证实miR-134可能作为NSCLC治疗的新的研究靶点。第一部分鉴定直接靶向EGFR的miRNAs[目的]通过靶基因预测软件找寻直接靶向EGFR但尚未被证实miRNAs,在NSCLC中验证所选的miRNAs是否能下调EGFR蛋白的表达,选择抑制作用最强的miRNA进一步研究,最终找到一个靶向EGFR的新的miRNA.[方法]1.应用靶基因预测软件(microrna.org, TargetScan)筛选可能直接靶向EGFR的miRNAs,根据mirSVR值进一步筛选。2.通过Western blot在NSCLC细胞系A549和H1299中检测转染miRNA模拟剂后EGFR蛋白的表达情况,选择抑制作用最强的miRNA:miR-134。3.通过Western blot在其他4株NSCLC细胞系H460、H520、H1975和PC9中进一步验证miR-134是否能下调EGFR蛋白表达,并通过qRT-PCR检测转染miRNA模拟剂后EGFR mRNA的表达情况。4.通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-134是否直接靶向EGFR mRNA的3’UTR端。5.通过Western blot检测miR-134转染后对EGFR下游信号通路的影响。[结果]1.通过靶基因预测软件,选择了3个miRNAs:miR-134、miR-200a和]miR-373进行验证,并以miR-7作为阳性对照。2. Western blot结果显示,在A549和H1299细胞中,转染miR-7模拟剂48和72小时后,EGFR蛋白表达明显受到抑制；与miR-200a和miR-373相比,转染miR-134模拟剂组48和72小时后EGFR下调更显著。因而,我们选定miR-134行进一步研究。3. Western blot结果显示转染miR-134模拟剂能使H520和H1975细胞中EGFR蛋白表达下调,而H460和PC9细胞中的EGFR蛋白表达无显著下调。在A549、H1299、H520和H1975细胞中,qRT-PCR进一步证实转染miR-134模拟剂后miR-134表达显著上调,而EGFR mRNA水平显著下调。4.双荧光素酶报告基因实验证实miR-134直接作用于EGFR mRNA的3’UTR端,从而抑制EGFR的表达。5. Western blot结果显示,在A549、H1299、H520和H1975细胞中,转染miR-134模拟剂能使磷酸化EGFR (p-EGFR)表达显著下调,且EGFR下游信号通路亦受到不同程度的抑制。[结论]1.过表达miR-134能下调NSCLC细胞系(A549、H1299、H520和H1975)中EGFR的mRNA及蛋白质表达水平。2. EGFR mRNA的3’UTR端是miR-134的直接作用靶点。3.过表达miR-134能下调NSCLC细胞系(A549、H1299、H520和H1975)中p-EGFR表达,且对EGFR下游信号通路有不同程度的抑制作用,说明miR-134可能发挥抑癌基因的作用。第二部分miRNA-134抑制NSCLC增殖、迁移及侵袭的体外实验研究[目的]第一部分研究显示miR-134抑制多个NSCLC细胞系中EGFR的表达,并不同程度的抑制了EGFR的下游信号通路,提示miR-134可能发挥抑癌基因的作用。本部分通过体外细胞实验来证实miR-134是否能抑制NSCLC的细胞增殖、迁移及侵袭,并对相关机制做进一步分析。[方法]1.MTT法检测过表达miR-134对NSCLC细胞系(A549、H1299、H520和H1975)增殖的影响。细胞周期和细胞凋亡检测分析miR-134抑制NSCLC细胞增殖的可能机制。2. Transwell小室迁移和侵袭实验分析过表达miR-134对NSCLC细胞系(A549和H1299)迁移和侵袭的影响。3.RNA干扰分析沉默EGFR后是否能模拟miR-134过表达引起的NSCLC细胞系(A549和H1299)表型改变。靶基因回复实验进一步验证EGFR是否为miR-134的功能靶点。4.通过靶基因预测和文献检索找寻其他可能的miR-134的功能靶点。5.RNA干扰和靶基因回复实验验证ITGB1是否为miR-134的功能靶点。[结果]1.在NSCLC细胞系(A549、H1299、H520和H1975)中,过表达miR-134显著抑制细胞增殖,在转染3天和4天后差异有统计学意义。机制分析显示,miR-134可能通过诱导细胞凋亡和／或诱导G0/G1期细胞周期阻滞而抑制NSCLC细胞增殖。2. Transwell小室迁移和侵袭实验显示,过表达miR-134显著抑制了A549和H1299细胞的迁移和侵袭。3.RNA干扰沉默EGFR后,A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭均受到抑制,与过表达miR-134的结果相似。靶基因回复实验显示,在A549和H1299细胞中回复EGFR表达后部分阻断了miR-134转染对细胞增殖的抑制作用,而对细胞迁移和侵袭的抑制影响不大,说明miR-134抑制A549和H1299细胞增殖的机制与其下调EGFR有一定关系,但其抑制A549和H1299细胞迁移和侵袭的机制与下调EGFR无关,需要鉴定其他可能的靶基因。4.通过靶基因预测软件和文献检索,选择了3个可能参与miR-134抑制迁移和侵袭的靶基因：KRAS、FOXM1和ITGB1,进行mRNA表达水平验证。在A549和H1299细胞中,miR-134对ITGB1 mRNA的抑制作用均最强,于是选择ITGB1进行Western blot检测。Western blot结果证实miR-134能显著下调ITGB1蛋白的表达。5.RNA干扰沉默ITGB1后,A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭均受到抑制,与过表达miR-134的结果相似。靶基因回复实验显示,在A549和H11299细胞中回复ITGB1表达后部分阻断了miR-134转染对细胞增殖、迁移和侵袭的抑制作用,说明miR-134抑制A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭的机制与其下调ITGB1有一定关系。[结论]1.miR-134抑制NSCLC细胞系(A549、H1299、H520和H1975)的细胞增殖,抑制A549和H1299细胞迁移和侵袭,在NSCLC中发挥抑癌基因作用。2. EGFR是miR-134抑制A549和H1299细胞增殖的功能靶点,但不参与miR-134对细胞迁移和侵袭的抑制作用。3. ITGB1是miR-134抑制A549和H1299细胞增殖、迁移和侵袭的另一功能靶点。4.miR-134通过下调癌基因EGFR和ITGB1的表达而发挥抑癌基因作用。第三部分1miRNA-134抑制NSCLC生长和转移的体内实验研究[目的]第二部分通过体外细胞实验证实miR-134通过下调EGFR和ITGB1表达,在NSCLC细胞中发挥抑癌基因的作用。本部分进一步用裸鼠异种移植瘤模型,验证miR-134能否在体内抑制NSCLC的生长和转移。[方法]1.选择4-5周雌性裸鼠构建A549异种移植瘤模型,待肿瘤直径达5-6mm时随机分成2组,分别瘤内注射miR-134激动剂或是阴性对照,每3天一次,共5次,并每3天测量肿瘤直径,绘制肿瘤生长曲线。2.末次注射miR-134激动剂或是阴性对照48小时后处死小鼠,收集肿瘤组织。qRT-PCR检测肿瘤中miR-134的表达情况,Western blot检测肿瘤中EGFR和ITGB1蛋白表达情况。3.肿瘤组织经福尔马林固定、石蜡浸泡制作蜡块及石蜡切片,应用免疫组化分析肿瘤组织切片中EGFR、ITGB1、增殖标志Ki-67、凋亡标志Cleaved PARP、上皮间质转化(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT)标志E-cadherin和Vimentin的表达情况。[结果]1.瘤内注射miR-134激动剂显著抑制裸鼠A549异种移植瘤的生长。2. qRT-PCR证实,瘤内注射miR-134激动剂组中miR-134显著上调。Western blot和免疫组化结果显示,瘤内注射miR-134激动剂组的EGFR和ITGB1的蛋白表达明显下调。3.免疫组化结果显示,瘤内注射miR-134激动剂组中,Ki-67蛋白表达下调,Cleaved PARP蛋白表达上调,E-cadherin蛋白表达上调,而Vimentin蛋白表达下调。[结论]1.miR-134能在体内发挥抑瘤作用,是潜在的肿瘤治疗新靶点。2.miR-134可能通过下调EGFR和ITGB1表达、抑制肿瘤细胞增殖、促进肿瘤细胞凋亡以及抑制EMT,从而抑制A549异种移植瘤的生长和转移。