肺腺癌(Human Lung Adenocarcinoma)是目前全世界癌症治疗的最大挑战之一，全球每年新增肺腺癌161万例（占所有癌症的12.7％），每年死亡138万人（占所有癌症的18.2％），因其死亡率最高而被认为是对人类健康与生命危害最大的恶性肿瘤。而其中非小细胞肺癌占所有肺腺癌病例的85％。在临床上，放射疗法经常与化疗联合用来治疗非小细胞肺癌，虽然诊断和治疗水平在不断提高，但是肺腺癌的发病率和致死率仍然居高不下，传统疗法有其局限性，因此研发有较小副作用和药物抗性的新型抗肿瘤药物变得非常重要。当今的研究热点主要集中在诱导肿瘤细胞凋亡、免疫治疗等靶向治疗方面。　　 细胞凋亡是一种由多基因控制的自主的程序性死亡方式。经典的细胞凋亡信号通路主要包括:死亡受体介导的外源性途径和线粒体介导的内源性途径。在凋亡起始阶段，上游的起始半胱氨酸蛋白酶(Caspase)被死亡受体或线粒体介导激活，活化的Caspase可以启动其下游的Caspase级联反应即效应阶段，从而使细胞走向死亡。而Caspase的活化受到严格地调控，Bcl-2蛋白家族就是主要的调控因子，其中的Bax/Bak、Bid及Bim等促进凋亡而Bcl-xL、Mcl-1等抗凋亡。　　 青蒿素是我国学者首次从菊科植物黄花蒿中提取的一种具有过氧化物桥结构的倍半萜内酯类化合物。近些年国内外的研究表明，青蒿素类药物除了高效的抗疟疾外，还具有很强的抗肿瘤功效，包括肺腺癌。进入细胞后，青蒿素的过氧化物桥结构通过与细胞中的Fe2+反应，产生大量的碳自由基和活性氧，破坏了细胞内的氧化还原稳态，进而诱导肿瘤细胞发生凋亡。然而，青蒿素诱导人非小细胞肺癌的细胞凋亡机制还不是完全清楚。研究青蒿素诱导肿瘤细胞凋亡的机制，对癌症的临床治疗具有重要意义。　　 本论文主要分为四个部分:　　 第一部分主要在非小细胞肺癌(A549)细胞系中，利用细胞活性检测、流式细胞术等检测了青蒿素诱导的肿瘤细胞死亡方式、活性氧的产生等。实验结果:　　 (1)随着青蒿素处理浓度的增加和处理时间的延长，A549细胞的凋亡率逐渐升高，400μM/L的青蒿素处理48 h能够导致大于50％的细胞死亡;(2)青蒿素处理后A549细胞膜上的磷脂酰丝氨酸外翻显著增加，表明细胞死亡方式是凋亡;(3)青蒿素在细胞中快速反应产生了大量的活性氧，并且用活性氧的清除剂预处理显著地抑制了青蒿素引起的细胞凋亡。以上结果证明:青蒿素诱导了剂量和时间依赖的A549细胞凋亡，而且活性氧在其中发挥了重要的作用。　　 第二部分重点通过RNA干扰、荧光底物实验、Western Blot等技术研究了Caspase-8、9和3在青蒿素诱导的A549细胞凋亡中的活化及其之间的调控关系。实验结果表明:(1) Caspase的抑制剂在A549细胞系中有很好的抑制专一性，即Caspase-8、9和3各自的抑制剂只抑制相对应的Caspase，而对别的Caspase没有明显的影响。(2) Caspase抑制剂和RNA干扰预处理很好的抑制了青蒿素诱导的A549细胞死亡，荧光底物实验验证了青蒿素引起的Caspase的活化;(3)最重要的是，Caspase-8、9和3各自的抑制剂或RNA干扰不仅抑制相对应的Caspase，而且对别的Caspase也有几乎完全的抑制作用;(4)活性氧的清除剂也能够完全抑制三个Caspase的活化。这些结果说明青蒿素诱导了一个Caspase-9、8和3之间的放大活化环来主导A549的凋亡，并且活性氧是重要的上游调控因子。本文推测早期活化的少量的Caspase-9和8虽然不足以启动细胞凋亡程序但是却能够相互切割活化，最终在A549细胞中形成Caspase-9、8和3之间的放大活化环。　　 在第三部分中探索了Caspase放大活化环的一些上游信号通路，即这个活化环是如何启动和调控的。运用共聚焦荧光成像技术、蛋白过表达技术以及Western Blot技术等，发现青蒿素诱导的活性氧依赖的Caspase-8、9和3的放大活化环的上游信号通路中，膜电位没有下降、细胞色素C没有释放到细胞质中而且RNA干扰Bax或者过表达Bax对青蒿素引起的A549细胞凋亡均没有影响。但是RNA干扰Bak却显著地阻止了青蒿素导致的A549细胞死亡，而且青蒿素处理的早期就引起了Smac从线粒体释放到细胞质中。于是，根据这些数据本文推测，青蒿素进入细胞后与Fe2+反应产生大量的活性氧，然后使Bak活化形成孔道而释放出Smac，在细胞质中Smac通过与其他凋亡调控因子一起激活少量的Caspase-9，之后通过放大活化环的方式直接切割活化大量的Caspase-8、9和3，最终导致细胞死亡。　　 第四部分研究了像A549细胞系中的这种Caspase放大活化环是否在更广的范围内存在。分别用青蒿素处理Hela细胞系和HepG2细胞系，结果显示青蒿素不同程度的导致了这些细胞的死亡，但是Caspase-8、9和3的抑制剂对这些细胞系却没有保护作用。而且，在星形孢菌素和紫外线诱导的A549细胞凋亡中也没有发现Caspase活化环。综上结果得出结论:青蒿素诱导的Caspase放大活化环是具有细胞类型特异性的。　　 青蒿素诱导Caspase放大活化环机制为开发新的青蒿素衍生物等抗肿瘤药物提供潜在的可能，这些新药物若能够快速靶向激活Caspase放大活化环，从而导致肿瘤细胞凋亡，达到治疗癌症的目的。而对青蒿素诱导细胞凋亡机制的研究则可以推动青蒿素药物在肿瘤临床治疗上的应用，为设计治疗方案提供有力的实验支持和理论依据。