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背景：谷胱甘肽过氧化物酶1(Glutathione peroxidase1, Gpx1)是细胞内关键性的抗氧化酶,可以解毒H202为H20,对维持细胞内氧化/还原平衡发挥了关键性的作用。近来研究表明Gpx1表达失调与许多心血管疾病的发生、发展密切相关。尽管目前,许多研究者对核转录因子κB(NFκB)和活化剂蛋白-1(AP-1)对GPxl在转录水平的调控进行了深入研究,但是目前在氧化应激下Gpxl如何在转录后水平受调控的机制尚未完全阐明。一种参与了调控心脏许多生理和病理过程的转录后调控机制便是microRNA (miRNA)。近来人们对miRNA这一内源性调控因子的认识逐渐加深。作为非编码]RNA(non-coding RNA)家族新成员之一的miRNA是一类长度约为22个核苷酸的调控性小RNA分子,它可以通过]mRNA的剪切和抑制蛋白质翻译的方式负调控靶基因。区别于其他调节因素“有”或“无”的调节特点,miRNA主要表现为在数量和程度上影响其靶基因水平,且只需通过几个碱基互补便可发挥作用。miR-181家族有四个成员(miR-181a、miR-181b、miR-181c以及]miR-181d),目前研究发现]miR-181a参与了免疫、代谢、炎症、凋亡等多种生理和病理过程。氧化应激应答的miRNA是否可以通过调控抗氧化酶的表达淬灭ROS而维持细胞内氧化还原稳态或者miRNA通过调控ROS下游的某些基因参与了氧化应激相关疾病的发生是本课题关注的重点。目的：1.探讨合适浓度H2O2介导的H9c2细胞氧化应激模型,并筛选可调控GPx1表达的niRNAs分子。2.寻求合适的转染浓度；探讨来源于大鼠的miR-181a是否可调控H9c2细胞内Gpx1的表达。3.探讨]miR-181a是否通过调节Gpx1的表达参与了氧应激诱导的H9c2细胞凋亡损伤过程。方法：1.复苏培养H9c2细胞,用不同浓度H2O2(50、100、200、400、800nmol/L)孵育H9c2细胞2小时后,CCK8法评价细胞存活率,TUNEL法检测H9c2细胞凋亡；Western blot方法检测不同H202浓度诱导下Gpx1表达变化。生物信息学软件筛选出可调控Gpx1表达的miRN As,在H9c2细胞中通过荧光定量PCR验证筛选出的miRNAs,并观察不同浓度H202对miRNA表达的影响。2.用不同浓度含Cy3标记的miR模拟剂(miR mimic)转染H9c2细胞,荧光显微镜下计数阳性细胞。构建含Gpx13’UTR双报告载体和突变载体,并同niR-181a模拟剂共转染HEK293细胞,荧光照度计测定荧光值。荧光定量PCR检测转染后miR-181a的表达;Western blot方法检测转染后Gpx1的表达。3.使用筛选出的miRNA化学合成模拟物及抑制物瞬时转染H9c2细胞,在检测前2小时加入400μmol/L H2O2,实验分6组,分别为：正常对照组；H202组；H202加niR-181a模拟物组；H202加模拟物对照(miR-CTL)组,H202加miR-181a抑制剂(anti-miR-181a)组；H202加miR-181a抑制剂对照组(anti-CTL)组。通过试剂盒检测乳酸脱氢酶(LDH)及丙二醛(MDA)水平；通过流式细胞仪检测细胞的凋亡水平；DCFH-DA法观察细胞内ROS的变化水平,JC-1试剂盒检测细胞线粒体膜电位的变化。Western blot分析凋亡蛋白Bcl-2、Bax及cleaved caspase-3的表达量的变化。细胞免疫荧光观察细胞色素c的释放。结果：1.随着H202浓度的增加,H9c2细胞存活率呈现浓度依赖性下升,而凋亡率呈现浓度依赖性上升,与对照组相比,差异有统计学意义(P<0.05)；Gpxl的表达随着H202浓度的增加呈现一个先上升后下降的趋势(P<0.05)。联合多个预测软件,预测出miR-7a, miR-125a, miR-181a以及miR-423可能调控3px1的表达。荧光定量PCR检测到400μmol/LH202处理H9c2细胞2h后候选miRNAs中仅niR-181a表达较正常组细胞上升,而其他候选niRNAs下降(P<0.05)；不同浓度H202处理H9c2后,400μmol/L H2O2浓度时miR-181a的表达达到顶峰(P<0.05)。2.随着Cy3标记的miR mimic浓度的增加,其转染效率逐渐增加,50nmol/L miR mimic组的转染效率达(96.9±4.23%)。成功构建双荧光酶素报告载体以及突变体,实验组的报告荧光比对照组明显下降(*P<0.01),而突变体的荧光强度下降不明显,差异无统计学意义。进一步研究发现转染：miR-181a抑制剂后导致H9c2细胞中miR-181a的表达下调,而Gpxl的蛋白表达略有上升；相反转染miR-181a模拟剂后导致niR-181a的表达上调,而Gpx1的蛋白表达明显下调。3.与相应对照组相比,miR-181a抑制剂组H9c2细胞的LDH、MDA、细胞的凋亡率、细胞内活性氧(ROS)的水平、Bax、cleaved caspase-3的表达量及线粒体向细胞质释放的细胞色素c均明显下降,细胞内线粒体膜电位水平及Bcl-2的表达量升高,而miR-181a模拟剂却拮抗了上述变化(P<0.05)。结论：1.400μmol/LH2O2浓度为最佳氧化应激模型浓度；miR-181a和Gpx1对H202的刺激呈现相反趋势。结合生物信息学,推测niR-181a可调控Gpx1的表达。2.50unol/L miR mimic为合适转染浓度。miR-181a在氧应激介导的心肌细胞凋亡中扮演了关键性的作用,并可负性调控Gpx1的表达。3.niR-181a能够增加H2O2诱导的氧化应激条件下H9c2心肌细胞损伤,促进H9c2,心肌细胞凋亡。]miR-181a通过调控Gpx1的表达在H202介导的H9c2细胞线粒体凋亡途径中扮演了关键性的作用。