研究背景及目的狂犬病病毒(Rabies Virus, RV)属于弹状病毒科,狂犬病病毒属,形态呈子弹状,长180nm,直径75nm,其头部为半球形,末端常为平端,病毒颗粒由外壳和核心两部分组成。其基因组由11928～11932个核苷酸组成,为单链、不分节段的负链RNA,含5个大的开放阅读框,编码5种结构蛋自。基因组从3’端至5’端的排列顺序为N、P、M、G和L基因,分别编码病毒核蛋白(nucleoprotein, NP)、磷蛋白(phosphoprotein, NS)、膜基质蛋白(matrix protein,MP)、糖蛋白(glycoprotein, GP)和转录大蛋白(polymerase, LP)。近年来的研究表明,狂犬病毒疫苗诱导机体产生中和抗体的免疫应答反应主要与核蛋白和糖蛋白有关。核蛋白在病毒颗粒中数量众多,占病毒蛋白总量的36%。核蛋白基因序列相对恒定,点突变较少,不同株系的同源性在98%～99.6%,是病毒中最稳定的蛋白,可用作检测抗原,也是狂犬病病毒基因分型的主要依据。核蛋白能诱导保护性免疫。它是一种能诱导对不同型狂犬病病毒产生交叉保护的T辅助细胞(Th)抗原,蛋白的21～35区域、394～408区域、404～418区域是主要的Th细胞表位。狂犬疫苗接种后,入外周血分离到的狂犬特异性的反应T细胞要比其它疫苗接种后分离到的特异性T细胞数量多,在这些特异性反应T细胞中,多数是Th细胞,它们绝大多数表现对核蛋白特异性反应,提示核蛋白是诱导狂犬病细胞免疫的主要成分。此外,核蛋白还能促进中和抗体的产生。把NP加福氏完全佐剂初免小鼠后,用灭活狂犬病毒加强,中和抗体水平明显上升,而用GP加强,中和抗体产生不明显。NP抗体还能抑制狂犬病毒在细胞间的传播和在细胞内的繁殖。因此,核蛋白是狂犬病毒疫苗组分中不可缺少的成分之一,是评价疫苗活力的一个重要指标。GP是狂犬病毒中唯一能刺激机体产生中和抗体的抗原,其抗原性的保持主要依赖于其空间构象。狂犬病毒GP的结构特点与其抗原性和免疫原性密切相关,它在刺激机体产生免疫应答的过程中发挥重要作用。GP是狂犬病毒的主要保护性抗原。具有B、T细胞识别位点,能够诱导机体发生细胞和体液免疫应答,刺激机体分泌中和抗体。因此,糖蛋白羧基末端是否缺失及其主要抗原位点空间构象是否被破坏或缺失是衡量狂犬疫苗抗原活力好坏的另一个关键性指标。狂犬病毒核蛋白、糖蛋白含量是狂犬病疫苗的主要质量指标,在精制狂犬病疫苗的研制过程中常需要及时进行抗原含量的检测,多年来一直用NIH动物法测定。该方法测定周期长,操作繁琐,以及国际动物保护协会对实验动物使用的制约,不适用于提纯过程中各步骤的监测。因此,寻求可靠的体外检测狂犬病毒疫苗效力的实验方法来替代NIH法势在必行。本研究采用时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)技术研制人用狂犬病毒N蛋白、G蛋白定量检测试剂,评价各项性能指标,并与其它检测试剂盒进行比较,评价其在临床检测应用中的可行性。时间分辨免疫荧光分析(TRFIA)是以稀土离子标记抗原或抗体、核酸探针和细胞等为特征的新型的非放射性免疫标记技术,它克服了ELISA酶标记物的不稳定、O.D值仅在低浓度范围与酶活性呈线性关系,Hook效应严重、酶的活性容易失活,灵敏度不高等缺点,使非特异性信号降低到可以忽略的程度,达到极高的信噪比,从而大大地超过了放射性同位素所能达到的灵敏度,且还具有标记物制备简便、储存时间长、无放射性污染、检测重复性好、操作流程短、标准曲线范围宽、不受样品自然荧光干扰和应用范围十分广泛等优点,成为继放射免疫分析之后标记物发展的一个新里程碑,已成为生物医学研究和临床超微量生化检验中一项最有发展前景的分析手段,有望未来实现代替NIH法为检测狂犬疫苗效力。方法：采用双抗体夹心法研制人用狂犬病毒核蛋白定量检测试剂,评价各项性能指标；采用杂交瘤融合法制备狂犬病毒糖蛋白单克隆抗体。1.人用狂犬病毒N蛋白定量检测试剂的研制与应用1.1狂犬病毒N蛋白抗原的制备：根据狂犬病病毒CTN株N基因序列设计引物,提取狂犬病毒CTN株疫苗总RNA,采用AMV酶逆转录获得cDNA,利用PCR的方法从cDNA中扩增N基因,将该基因片段定向克隆到原核表达载体p ET32a (+)中,构建原核表达载体p ET32a/N。阳性重组质粒转化原核表达宿主菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达并确定表达N基因的最佳诱导时间。SDS-PAGE和Western-blot对表达产物进行检测和分析。1.2人用狂犬病毒抗N蛋白单克隆抗体的制备：以狂犬病毒全蛋白为抗原免疫Bal/C小鼠,效价达到1：64000后,采用杂交瘤融合的方法制备单克隆抗体,再NP抗原对抗体进行筛选,筛出14株抗NP单抗。1.3人用狂犬病毒抗N蛋白单克隆抗体的纯化：用Protein G Sepharose4Fast flow亲和层析柱纯化,并用BCA试剂盒测抗体浓度。1.4铕标记抗体与纯化：将抗N蛋白抗体分别取0.5mg加入50KD的蛋白超滤离心柱中,9000r/min离心8min。再用标记缓冲液(50mmol/L,Na2CO3,pH9.0)重复洗涤6次。将200μl标记抗体和50μg铕标记试剂充分混匀,25℃振荡过夜。标记完成后加入蛋白超滤离心柱中,9000r/min离心8min。再用洗脱液(含0.9%NaCl的50mmol/L Tris-HCl)重复洗脱6次,弃滤液,最后再加入500μl洗脱液,静置2min后,倒扣9000r/min离心5min,收集滤液。1.5单抗配对筛选：先用狂犬病毒原液作为双抗夹心的标准品,将14株抗NP单抗一一包被,与另外13株铕标配对,绘制标准曲线,筛出配对得上的单抗,再用自制NP和企业标准品作为标准品,从中绘制标准曲线,最终筛出配对得上的单抗。1.6试剂盒性能指标考核：准确性测试(稀释回收率)、线性范围的检测、灵敏度(最低检测量)、精密度测试、稳定性测试、自制试剂与其他试剂比较。1.6.1准确性测试(稀释回收率)：将样品1、样品2、样品3分别按1：200,1：400,1：800和1：1600倍比稀释,每次试验作3复孔,重复测定3次,n=3×3,计算其测定值、真实值、标准差和回收率。1.6.2线性范围的检测：将参考标准品抗原稀释成不同浓度进行测定。每一浓度测试值作3复孔,测试3次,n=3×3,计算试验的测定值、真值及其比值,分析线性回归并计算试验的相关系数r。1.6.3灵敏度(最低检测量)：以标准品稀释液作为空白零点(A)当作样品测量,每次试验设8复孔,重复3次,n=8×3,计算其均值及标准差。1.6.4精密度测试：分析内精密度：将企业标准品A-F点各做10个复孔,计算其均数、标准差及CV值；分析间精密度：将企业标准品A-F点由3个不同的技术员来操作,分别各做10个复孔,计算其均数、标准差及CV值。1.6.5稳定性测试：将自制试剂盒分别置于4℃冰箱半年和37℃7天,对各条件下试剂盒的物理外观、剂量-反应曲线的线性、准确性、精密度、最低检出量、特异性等指标进行测定。1.6.6与武汉研究所狂犬病毒N蛋白ELISA试剂盒测值比较：将自制试剂盒与武汉所ELISA狂犬病毒检测试剂盒同时进行样品测定,并计算其相关系数。2.人用狂犬病毒G蛋白单克隆抗体的制备：以人用狂犬病毒疫苗免疫Bal/C小鼠,效价达到1：64000后,采用杂交瘤融合的方法制备单克隆抗体,用狂犬病毒原液和GP筛选阳性株,再用实验室自制NP、人白蛋白对抗体进行反筛,筛出48株抗GP单抗。结果：成功的将狂犬病毒N蛋白基因克隆到p ET32a(+)原核表达质粒,经PCR、限制性酶切和测序等鉴定,成功构建了p ET32a/N重组原核表达质粒。重组质粒pET32a/N在大肠杆菌中表达出狂犬病毒N蛋白的融合蛋白,分子量约为70kDa,与理论值基本符合,表达产物主要以包涵体的形式存在。重组蛋白经过包涵体洗涤Ni亲和层析纯化后,纯度均达90%以上。用抗His标签抗体对表达产物进行Western-blot分析,发现特异性条带出现在70kDa处,表明该蛋白确实是所要表达融合蛋白。用纯化的狂犬病毒免疫小鼠,三次免疫后效价达到1：64000,细胞融合制备得14株抗NP单克隆抗体,ELISA酶免结果显示：自制单克隆抗体能与天然蛋白能发生特异性反应,说明制备的单抗均为特异性单抗。用时间分辨的方法筛选得到F023和F022一对配对抗体,并用这对抗体制备狂犬病毒N蛋白试剂盒。NP试剂盒准确度好,线性范围为5～2500mEU/ml,灵敏度为1.018mEU/ml,精密度良好,分析内精密度为2.7%～9.3%,分析间精密度为3.5%～12.2%。稳定性试验表明,试剂可以在4℃稳定半年,37℃稳定7天。与武汉研究所狂犬病毒N蛋白ELISA试剂盒测值比较,本试剂盒检测所得结果与武汉所N蛋白试剂盒趋于高度一致。用狂犬病毒疫苗免疫Bal/C小鼠,效价达到1：64000后,采用杂交瘤融合的方法制备单克隆抗体,用狂犬病毒原液和GP筛选阳性株,再用实验室自制NP、人白蛋白对抗体进行反筛,筛出48株抗GP单抗,ELISA酶免结果显示：自制单克隆抗体能与天然蛋白能发生特异性反应,说明制备的单抗均为特异性单抗。结论：以上结果表明,本研究成功地构建了p ET32a/N原核重组表达质粒,并在大肠杆菌中大量表达出具有免疫活性重组蛋白；筛选、鉴定获得14株分泌狂犬病毒抗NP单克隆抗体的杂交瘤细胞株,并从中筛选得到一对配对抗体,用这对抗体研制的人用狂犬病毒核蛋白定量检测试剂的各项指标(准确性、灵敏度、精密度、稳定性等)均达到临床检测试剂要求,有望代替国内外同类产品进行样品检测。成功获得了人用狂犬病毒抗GP单克隆抗体48株,为狂犬病毒糖蛋白免疫学检测试剂提供原料。