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作为新近发现的共信号分子，B7-H3在T细胞免疫应答中的作用还存在较大争议，这也提示该分子功能具有多样性。与功能相比，B7-H3表达谱比较明确。该膜分子可在肿瘤组织以及诱导活化的单核巨噬细胞表达，且与临床进展密切相关。如前所述，共信号分子通常存在膜性以及可溶性两种形式，那么是否也存在可溶性B7-H3，有何临床意义？除可以调控T细胞免疫应答外，最近发现B7-H3也可调控其他组织细胞的生物学行为，那么B7-H3是否可以参与调控单核-巨噬细胞生物学功能，其机制如何？B7-H3在多种肿瘤组织呈异常高表达且与临床进展密切相关，那么肿瘤微环境中髓系来源细胞是否也表达该分子，表达的临床意义及作用机制如何？针对上述问题，本论文开展如下研究：第一部分：可溶性B7-H3的生物学特性及其检测的临床意义目的：研制sB7-H3定量检测试剂盒，鉴定人体内是否存在sB7-H3，并分析其生物学特征及其检测的临床意义。方法：利用自主研发的抗人B7-H3单抗4H7和21D4双夹心法配制sB7-H3ELISA检测试剂盒。在此基础上，检测不同年龄阶段健康人血清（血浆）中sB7-H3含量。检测外周血免疫细胞如树突细胞、淋巴细胞、单核细胞以及长期细胞株等膜型以及培养上清中可溶性B7-H3表达水平，并利用金属蛋白酶抑制剂进行干预，分析sB7-H3产生的可能机制。利用Western-blotting实验分析浓缩细胞培养上清中sB7-H3分子量，并利用流式细胞技术，分析该浓缩天然sB7-H3是否可与体外活化的T淋巴细胞结合，分析该天然形式sB7-H3是否为功能片段。筛查不同疾病状态下sB7-H3表达水平，分析该可溶性分子表达的临床意义。结果：利用抗B7-H3单抗4H7为包被抗体，生物素标记单抗21D4为检测抗体，成功构建sB7-H3ELISA试剂盒。该试剂盒检测区间为27-20,000pg/ml，线性检测区间为20-1,600pg/ml。准确性，灵敏度都达到同类产品国际水平。利用该试剂盒，我们发现人体内存在天然形式的sB7-H3，且不同年龄阶段水平不尽相同，以脐带血水平最高，成年后则无明显变化。检测健康人外周血单个核细胞以及体外培养的树突细胞，我们发现健康人外周血免疫细胞几乎都检测不到膜型B7-H3表达，但是在体外诱导活化的T淋巴细胞、单核细胞以及树突细胞则能同时检测到膜型B7-H3以及sB7-H3表达。因此，我们推测膜B7-H3可能是sB7-H3来源。金属蛋白酶抑制试验中也证实MMPs参与了sB7-H3表达调控。Western-blotting证实该可溶性分子大小约为16.5kDa。竞争抑制试验表明该天然形式可溶性分子且可与活化T细胞结合，证明其为具有生物学活性的功能片段。临床检测发现，sB7-H3在细菌引起的炎症性疾病患者体内水平显著升高，而在病毒性感染患者sB7-H3则未见明显变化。结论：成功构建可以定量分析sB7-H3的ELISA试剂盒，证实人体内存在天然形式sB7-H3，其来源为金属蛋白酶剪切而来的膜型B7-H3，在细菌性感染患者体内明显升高，具有临床检测意义。第二部分：B7-H3协同TLR2/TLR4信号通路促进脓毒症炎症反应的机制目的：研究共信号分子B7-H3对单核巨噬细胞的调控作用，分析该分子在炎症应答中的作用机制。方法：临床标本分析脓毒症患者外周血淋巴细胞及单核细胞上B7-H3R表达，并分析B7-H3R表达的调控机制。在此基础上，利用小鼠B7-H3Ig融合蛋白以及抗小鼠B7-H3阻断型单抗，研究炎症反应条件下B7-H3对骨髓来源巨噬细胞的调控作用。构建TLR-2以及TLR4基因过表达工程细胞株293，分析B7-H3发挥生物学作用是否依赖于TLR2/4信号。此外，构建内毒素动物模型，利用抗B7-H3抗体进行体内干预，分析B7-H3体内炎症应答中的生物学作用及对疾病进展的影响。结果：临床标本检测发现sB7-H3可以与单核巨噬细胞上潜在受体结合；进一步研究发现该分子以协同作用方式，增强LPS及BLP诱导的炎症反应，促进单核巨噬细胞分泌炎性细胞因子IL-6以及TNF-α。作用机制研究表明B7-H3协同作用依赖于TLR-2/4信号通路并可显著促进NF-κb活性。体内实验也证实阻断B7-H3抑制炎症应答，并可显著延长脓毒症小鼠生存时间。结论：本研究首次提出在脓毒症患者体内B7-H3的效应细胞为单核巨噬细胞，其在炎症应答中的生物学作用主要表现为依赖TLR信号调控固有免疫应答促进炎性细胞因子分泌。第三部分：组织浸润B7-H3+MDSC的生物学特性及其在肺癌免疫逃逸中的作用目的：分析肿瘤浸润部位B7H3+HLA-DR-CD14+MDSC表达特征、临床意义以及生物学功能。方法：收集手术切除的非小细胞肺癌癌灶部位、癌远端组织标本以及对应外周血标本60例，组织标本经过胶原酶消化处理、Ficoll分离获得单个核细胞；外周血标本直接溶血，检测组织以及血标本中HLA-DR-CD14+MDSC表达；分析B7协同刺激分子在该类细胞上的表达特征，结合病例资料分析其临床意义，通过体内外实验比较分析B7-H3-以及B7-H3+MDSC在表型、临床意义以及生物学功能等方面的差异。结果：（1）与健康对照相比，非小细胞肺癌患者外周血HLA-DR-CD14+MDSC比例显著升高(P<0.01)，B7-1、B7-2、B7-H1、B7-H2、B7-H3以及B7-H4都没有显著差异（P>0.05）；（2）HLA-DR-CD14+MDSC比例在肿瘤浸润部位较癌远端组织显著升高(P=0.02)，B7-H3在癌灶部位HLA-DR-CD14+MDSC上较癌远端组织表达显著升高（P<0.01），其他B7家族协同刺激分子均无统计学差异（P>0.05）；（3）更为有意义的发现是，以B7-H3单抗圈门可以将HLA-DR-CD14+MDSC分为两个亚群：B7H3+以及B7H3-HLA-DR-CD14+MDSC；（4）结合病史，比较分析两类MDSC的临床意义，结果发现仅B7-H3+MDSC与肿瘤分期以及淋巴结转移密切相关（P<0.05）；（5）以流式细胞分选技术从浸润肺癌组织分离获得高纯度B7H3+以及B7-H3-MDSC两亚群细胞，并比较其对CD3+T功能的影响，结果发现两亚群细胞均能有效抑制T细胞体外增殖（P<0.01），但两亚群之间并不存在显著差异（P>0.05）；（6）体内实验证实，未剔除B7-H3+MDSC组荷瘤小鼠较剔除组肿瘤生长更快（P<0.05）；分析两亚群对Treg体外扩增的影响，结果发现B7-H3+较B7-H3-MDSC更为有效扩增Treg（P<0.05）。（7）荷瘤小鼠实验进一步证实肿瘤微环境可以诱导B7-H3+MDSC，且发现B7-H3在介导MDSC诱生Treg中发挥了部分作用。结论：鉴定了一类以B7H3+表达为特征的新型MDSC亚群，并证实该新型MDSC亚群可通过诱生Treg在肺癌肿瘤免疫逃逸中发挥重要作用。