肌萎缩侧索硬化（Amyotrophic lateral sclerosis,ALS）是一种致死性的成人发病的神经退行性疾病,脊髓前角细胞、脑干后组运动神经元及锥体束受累,肢体和延髓上、下级运动神经元损害并存,可导致全身肌肉萎缩、瘫痪和无力,累及呼吸肌可导致患者死亡。目前,ALS发病机制尚不明确,至今仍没有有效的治疗方法。因此,迫切需要寻求新的有效的ALS临床治疗药物和方法。流行病学研究表明,绝经前的女性比男性或绝经后的女性更不容易罹患ALS和其它神经退行性疾病。资料表明雌激素可能在ALS中起到神经保护作用。人们一直在研究使用雌激素作为治疗神经退行性疾病的药物,17β-雌二醇（17β-estradiol,E2）已经被证明对于多种神经退行性疾病具有神经保护作用。雌激素受体（ER）是雌激素信号通路中的重要蛋白,在生殖、发育和代谢等生命过程中发挥重要作用,是一类重要的药物作用靶标。雌激素效应主要是由三种不同的受体介导的:两种经典的雌激素核受体ERα（estrogen receptorα）和ERβ,传统意义上起到核转录因子作用;第三种是膜受体GPR30（G protein-coupled receptor 30）,被认为是一种新的雌激素受体,调节雌激素的快速、非基因组效应。经典雌激素核受体（ERα和ERβ）和新型雌激素膜受体GPR30在雌激素的神经保护作用中起着不可或缺的作用。由于雌激素会增加乳腺癌、子宫内膜癌及脑卒中等不良事件的发生率,有使男性患者女性化的影响,因此E2的有利作用往往会被其不良的副作用和很差的依从性所限制。雌激素的这些潜在的局限性,引起了人们对非甾体类选择性雌激素受体调节剂（selective estrogen receptor modulators,SERMs）的兴趣,它具有神经保护作用,模拟雌激素的有益作用,却将其副作用最小化,因而有望成为雌激素替代治疗药物。雷洛昔芬（Raloxifene,Ral）作为雌激素受体调节剂,是通过结合经典雌激素受体ERα/ERβ发挥作用,也有研究报道其通过GPR30的调节发挥作用。在某些组织中,Ral的神经保护作用可能是通过GPR30和ERα/ERβ的协同作用来实现的。Ral是FDA批准的一种非甾体苯并噻吩SERM,临床用于治疗和预防更年期妇女骨质疏松症和浸润性乳腺癌。由于不会增加生殖器官癌症的风险,并且不具有使男性患者女性化的影响,Ral很可能成为替代E2的神经保护剂。然而,Ral对ALS的神经保护作用仍有待研究。近年来的研究表明,包括ALS在内的TDP-43蛋白质病的中枢神经系统细胞质内存在泛素阳性包涵体,其主要成分为43-kDa TAR DNA结合蛋白（TDP-43）。TDP-25,是TDP-43被激活的caspase-3裂解所产生的25-kDa C末端片段（C-terminal fragment-25,CTF25）。TDP-25容易发生错误折叠而形成聚合物,TDP-25的过度表达能够诱导线粒体自噬,导致泛素-阳性包涵体形成,促进细胞凋亡。TDP-25转基因小鼠因TDP-25表达增加,导致选择性的前肢功能损害,与ALS患者的表现相似。本实验室已经建立了稳定表达TDP-25的ALS细胞模型。将编码CTF25 cDNA的载体转染NSC-34细胞,称为TDP-25细胞,作为一种新的ALS细胞模型。将空的PCI-neo载体转染NSC-34细胞,称为E细胞,作为对照。TDP-25细胞可传代,CTF25的表达水平接近内源性TDP-43的47%。TDP-25细胞模型可作为研究ALS的发病机制和评价新的治疗方法的重要工具。证据表明,在某些神经退行性疾病中,激活的自噬可能加强毒性蛋白质聚集物的清除来提供神经保护作用。自噬与过度表达的TDP-25降解有关,自噬的激活是治疗与TDP-43蛋白质组相关神经退行性疾病的一种潜在的有效策略。也有研究显示,细胞凋亡可能在ALS的发病机制及其运动神经元的变性中发挥作用,神经元凋亡可能与ALS的发病和死亡率有关。动物实验研究中,生理浓度的E2干预后,神经元细胞死亡减少,抑制神经元凋亡。因此,我们推测Ral对神经元的作用可能与雌激素类似,通过增强自噬活性,抑制细胞凋亡,从而限制运动神经元的变性。在本研究中,我们评估并比较E2和Ral对TDP-25细胞的神经保护作用,并进一步研究Ral通过ERα/ERβ和GPR30途径对自噬和凋亡的影响,进一步探讨Ral对ALS细胞模型的神经保护作用机制,为ALS患者寻求更为理想的治疗药物,为在ALS神经保护药物开发中将ERα/ERβ和GPR30作为新的药物作用靶标提供证据支持。第一部分雌激素受体ERα/ERβ和GPR30在TDP-25细胞中的表达研究目的:观察雌激素受体ERα/ERβ和GPR30在TDP-25细胞的表达情况,为下一步的研究奠定基础。方法:应用本实验室已经建立的TDP-25细胞作为ALS细胞模型,通过免疫荧光染色和共聚焦荧光显微镜成像技术,来观察ERα、ERβ和GPR30在TDP-25细胞中的表达分布情况;通过Westernblot分析在TDP-25细胞中ERα、ERβ和GPR30蛋白的表达水平。结果:1.免疫荧光染色证实在TDP-25细胞中有ERα、ERβ和GPR30的表达。ERα主要集中在细胞核区域,细胞浆分布很少。ERβ在TDP-25细胞核及细胞质均有表达,分布更广泛,甚至在细胞的突起中也有明显表达。GPR30主要分布在细胞核及核周区域,分布局限,可见浓缩点状聚集,在细胞质内其它部分表达很少,在细胞周边部分无明显表达。在对照组中,GPR30的表达更加明显的局限在核周,核区分布相对较少,在细胞核及核周区域均未见点状聚集。2.Westernblot分析进一步证实了在TDP-25细胞中有ERα、ERβ和GPR30蛋白的表达。TDP-25细胞中GPR30蛋白表达水平明显高于对照组,ERα、ERβ蛋白表达水平与对照组相比无明显变化。第二部分雌激素和雷洛昔芬通过ERα/ERβ和GPR30促进TDP-25细胞的增殖目的:观察雷洛昔芬对TDP-25细胞增殖的影响,并探讨其通过ERα/ERβ和GPR30的作用途径,评估雷洛昔芬对TDP-25细胞的保护作用。方法:为了观察E2和Ral对TDP-25细胞增殖的影响,将TDP-25细胞接种到6、24或96孔板中,放入培养箱中孵育过夜至细胞贴壁,次日,用无血清的DMEM培养基持续24小时“雌激素饥饿”培养,继之更换为含10%v/v碳吸附（去雌激素）FBS的DMEM培养基,同时加入相应浓度E2和Ral进行干预。用Western印迹方法分析E2或Ral(10^-9M、10^-8M、10^-7M和10^-6M)干预后ERα、ERβ和GPR30在TDP-25细胞中的蛋白表达情况;用CCk-8试验观察E2或Ral干预后对TDP-25细胞活力的影响,并确定下一步实验方案中E2或Ral干预浓度;免疫荧光染色和共聚焦显微镜分析,观察E2或Ral(10^-7M)干预后ERα、ERβ和GPR30在TDP-25细胞内表达变化情况。用GPR30拮抗剂G15(10^-7M)或激动剂G-1(10^-7M)及ERα/ERβ拮抗剂ICI 182,780(10^-7M)预处理30 min后,再用E2(10^-7M)或Ral(10^-7M)干预,观察ERα/ERβ、GPR30对细胞活力变化的影响。结果:1.E2(10^-9、10^-8和10^-7M)干预组,TDP-25细胞的ERα、ERβ和GPR30蛋白表达水平显著高于对照组。在10^-8M和10^-7M Ral干预组,ERα和GPR30蛋白表达水平明显增加,而且在10^-7M Ral干预组中蛋白表达量最高。与E2干预组结果不同,ERβ蛋白表达水平随Ral浓度的增加并没有明显变化。2.CCK-8实验结果表明,10^-7 M E2或Ral明显增加TDP-25细胞活力,具有促进细胞增殖的作用。3.对照组TDP-25细胞经饥饿培养后,免疫荧光显示GPR30蛋白没有出现点状聚集,仅在细胞核和核周区呈现浅淡染色,在细胞质其它部位未见明显表达。经10^-7M E2处理24h后,GPR30在细胞质中的表达增高。值得注意的是,TDP-25细胞经10^-7M Ral干预后,GPR30在细胞质中的表达增多更明显。而ERα和ERβ表达在E2(10^-7M)或Ral(10^-7M)干预后均未见明显变化。结果表明,E2或Ral引起GPR30在TDP-25中胞浆表达明显增多。4.G15或ICI 182,780完全抑制了E2增强TDP-25细胞活力的作用,表明ERα/ERβ和GPR30都参与了E2诱导的促进细胞增殖作用。对Ral干预组,G15完全阻断了Ral增强TDP-25细胞活力的作用,而ICI 182,780并没有发挥阻断作用,表明GPR30参与了Ral诱导的促进细胞增殖作用,ERα/ERβ可能没有发挥作用。此外,G-1干预组TDP-25细胞活力明显高于对照组和G15干预组,进一步表明GPR30参与了Ral促进TDP-25细胞增殖的过程。第三部分雷洛昔芬对TDP-25细胞保护作用的机制研究目的:观察Ral通过ERα/ERβ和GPR30途径对自噬和凋亡的影响,进一步探讨雷洛昔芬对TDP-25细胞保护作用的机制。方法:将TDP-25细胞接种到6孔板中,放入培养箱中孵育过夜至细胞贴壁,次日,用无血清的DMEM培养基持续24小时“雌激素饥饿”培养,继之更换为含10%v/v碳吸附FBS的DMEM培养基,同时加入E2(10^-7M)或Ral(10^-7M)进行干预。用westernblot印迹法分析自噬标记物LC3-II和p62以及凋亡指标Bcl-2、Bax和Caspase-9在TDP-25细胞中的蛋白表达水平,评估E2和Ral对自噬或凋亡的影响。用GPR30拮抗剂G15(10^-7M)或激动剂G-1(10^-7M)及ERα/ERβ拮抗剂ICI 182,780(10^-7M)预处理30 min后,再用E2(10^-7M)或Ral(10^-7M)干预,观察ERα/ERβ、GPR30对细胞自噬或凋亡的影响。结果:1.E2干预后p62蛋白表达水平下降,LC3-II表达增加,表明E2增强了TDP-25细胞的自噬水平。p62蛋白表达水平下降,被ICI 182,780和G15阻断,表明ERα/ERβ和GPR30都可能参与了TDP-25细胞自噬流增强的调节作用。LC3-II表达增加,被ICI 182,780阻断,不被G15阻断,表明在E2干预后,ERα/ERβ可能参与了TDP-25细胞自噬的诱导激活,而GPR30并没有参与。分析以上结果表明,E2可能通过ERα/ERβ和GPR30共同作用参与了自噬调节,增强了自噬水平。2.Ral干预显著降低p62和LC3-II水平,表明Ral可能增强了TDP-25细胞的自噬流。p62水平下降被ICI 182,780和G15干预所逆转,表明ERα/ERβ和GPR30可能都参与了TDP-25细胞自噬流的增强。LC3-II的减少被ICI 182,780逆转,G15减弱LC3-II的下降,但统计学差异不显著,表明Ral可能通过ERα/ERβ参与调节了TDP-25细胞的早期自噬,而GPR30可能不发挥主要作用。分析以上结果表明,Ral的作用与E2相似,可能通过ERα/ERβ和GPR30共同作用参与了自噬调节,增强了自噬水平。3.E2干预后Bcl-2蛋白水平显著升高,Bax和Caspase-9蛋白水平下降,表明E2具有抑制TDP-25细胞凋亡的作用;并且这些效应被ICI182,780所阻断,表明ERα/ERβ参与了E2的抗凋亡过程;G15也阻断了Caspase-9的蛋白表达水平的下降,表明GPR30可能参与了E2的抗凋亡过程。此外,G1显著降低了caspase-9的表达,也进一步支持GPR30参与了E2的抗凋亡过程。Bcl-2和Bax蛋白水平的变化不被G15阻断,也不受G1的影响,表明GPR30没有影响Bcl-2和Bax蛋白水平的变化。分析以上结果表明,E2可能通过ERα/ERβ和GPR30共同作用抑制细胞凋亡。4.Ral干预显著降低caspase-9和bax水平,而Bcl-2蛋白水平与对照组无显著性差异,表明Ral也具有抑制TDP-25细胞凋亡的作用;ICI182,780和G15干预可阻断Caspase-9水平的下降,表明ERα/ERβ和GPR30都可能参予Ral的抗凋亡过程。此外,Bax水平在Ral干预后显著下降,这一作用被ICI 182,780而不是G15所阻断,表明ERα/ERβ参与了促凋亡蛋白Bax的减少,抑制了细胞凋亡。而G1干预并没有显著降低Caspase-9或Bax的水平。分析以上结果表明,Ral与E2相似,可能通过ERα/ERβ和GPR 30共同作用抑制细胞凋亡。结论:1.本研究结果表明,与E2类似,Ral通过ERα/ERβ和GPR30促进TDP-25细胞增殖,增强自噬,抑制凋亡,提供神经保护作用。2.Ral可模拟雌激素的有益作用,并且将雌激素的副作用最小化,因此很有可能成为ALS的一种很有前景的治疗手段。3.本研究突出了ERα/ERβ和GPR30对TDP-25细胞神经保护作用的影响,为ERα/ERβ和GPR30作为ALS神经保护药物开发中的新靶点提供了证据支持。