目的：建立糖尿病谷氨酸脱羧酶(GAD₆₅)反应性T细胞ELISPOT检测的优化方案。 方法：选取经典T1DM（T1A）患者、特发T1DM（T1B）患者及健康对照者（Control）各2例，2型糖尿病（T2DM）患者3例；连续梯度离心分离外周单个核细胞（PBMC）；参照U-CyTech公司（荷兰）的ELISPOT标准方案冻存、复苏PBMC及斑点检测，包括分泌IFN-γ的Th1斑点（IFN-γ-Th1）及分泌IL-4的Th2斑点（IL-4-Th2）；观察不同孵育法、孵育时间、刺激抗原、细胞数及新鲜或冻存细胞等对斑点的影响，并对其进行重复性评价。 结果：①直接法与预育法检测IFN-γ-Th1、IL-4-Th2斑点无显著差异（P＞0.05），但直接法较为简便；②5μg／ml T cell-GAD₆₅刺激36h为最佳浓度及孵育时间；③3.5×10⁵／100μl／孔的PBMC细胞浓度所形成IFN-γ-Th1与IL-4-Th2斑点数较多；④T cell-GAD₆₅刺激所得的IFN-γ-Th1斑点数明显高于同浓度（5 μg／ml）及20μg／ml非专用于T细胞检测的重组蛋白GAD（P＜0.05）；⑤按程序冻存及复苏的PBMC与新鲜分离的PBMC所形成的IFN-γ-Th1及IL-4-Th2斑点数无差别