SOX (SRY-like HMG box)基因家族是一类具有HMG (high mobility group)特征性结构域的转录因子家族。HMG是DNA结合区域,其基因序列在真核细胞内高度保守。目前,共发现20种SOX基因,分为10个亚类。SOX2是SOX家族组中一个主要成员,表达与胚胎干细胞,在胚胎的各个发育过程中起重要作用。近年来,发现SOX2是诱导人和鼠成体细胞细胞为pluripotency细胞的一个关键和必需的分子。干细胞和肿瘤都具有自我更新等共同特性,在干细胞起关键作用的基因在肿瘤的发生和发展中也起一定作用。SOX2已被发现在多种肿瘤中高表达,如肺癌、胰腺癌、乳腺癌和神经内分泌癌等；在中枢神经系统发育的早期,SOX2表达于全部的神经上皮,但神经系统发育成熟之后,其表达仅局限于胚基的神经胶质干细胞,而当神经胶质细胞恶变后,在脑胶质瘤中被激活而重新表达,表达显著高于正常组织,并且在RNA和蛋白水平上得到了证实。文献报道在结肠癌中SOX2高表达并且是判断预后的候选生物标记,并且SOX2的表达与干细胞标记CD133以及对化疗药物抵抗有相关性。然而SOX2结肠癌中的作用及其分子机理目前尚无研究。本研究中,我们在结肠癌细胞中应用基因干涉技术,观察SOX2基因对细胞生物学行为的影响,发现SOX2基因干涉后其增殖、克隆形成以及动物体内致瘤能力明显降低。我们利用了基因组,转录组以及蛋白质组学技术：基因表达芯片,Chip-Seq (chromatin immunoprecipitation-sequencin)和Co-IP-MS-MS (Immunoprecipitation coupled with mass spectrometry),应用系统生物学理念,探讨该基因对肿瘤发生的分子机理。1.免疫组织化学检测SOX2在结肠癌中的表达用免疫组织化学检测30例结肠癌组织和配对正常结肠组织SOX2蛋白的表达,结果表明SOX2在癌组织细胞核中的表达显著高于正常组织,差异有显著性。2.基因干涉技术对SOX2在肿瘤细胞中生物学功能的研究利用慢病毒介导的基因干涉技术,病毒感染结肠癌细胞后SOX2的表达显著下调,体外功能实验显示,SOX2基因基因干涉后细胞增殖能力和克隆形成能力显著减低,细胞周期呈现S和G2／M期阻滞；动物体内致瘤能力也显著降低。3.SOX2基因干涉后细胞基因表达谱的改变及生物信息分析SOX2基因干涉后,通过基因芯片表达谱分析,发现1205个基因的表达因SOX2基因干涉而下调；Go Ontology分析,这些下调的基因参与了数条重要生物过程,如：cell surface receptor linked signal transduction (GO:0007166), BMP signaling pathway (GO:0030509), response to retinoic acid (GO:0032526)等,说明SOX2可能通过这些基因表达水平的调节而调控这些生物过程。4. Chip-seq SOX2蛋白分子基因组结合位点分析我们利用Chip-seq技术确定了SOX2在基因组上的结合位点,并与表达谱芯片整合分析,进一步确定了SOX2在转录水平上可能直接调节的基因；并将SOX2在肿瘤中的结合位点与在胚胎干细胞中的结合位点进行比较,两者共有372个结合位点,说明Sox2在肿瘤中和在干细胞中对基因的调节具有一定的保守性。在结肠癌细胞中SOX2在基因组DNA上的结合位点富含AT序列,并且共有一共同motif:wwTGywTT;将SOX2的结合区域向两侧延伸,以发现SOX2结合区域内是否含有其他已知转录因子的结合motif,结果发现了已知的与SOX2有协同作用的OCT家族蛋白的结合motif,并且发现新的转录因子的结合motif如：Fox和HNF等家族蛋白的结合motif,这说明这些蛋白可能与SOX2共同参与对基因表达的调节。5. Co-IP-MS-MS SOX2相互作用蛋白的鉴定和分析Co-IP-MS/MS分析共鉴定到与SOX2蛋白相互作用形成复合物的蛋白144个,每个蛋白的可信度都大于0.9,并且每个蛋白在质谱中出现的肽段都至少有两个不同唯一肽段出现。随机选取了4个蛋白进行western-blot验证；我们发现在鉴定到的蛋白中,有很多蛋白为HnRNP家族蛋白,并与以往鉴定到的HnRNP复合物组分相比较,说明SOX2可能是HnRNP复合物的一个组分,SOX2与这蛋白相互作用参与了基因的表达各个过程的调节。6.整合分析整合基因表达谱改变、Sox2 DNA结合位点和Sox2相互作用蛋白,我们发现在Sox2基因组的结合区域存在CEBPB转录因子结合motif,在相互作用的蛋白中存在CEBPB蛋白,这说明Sox2可能与和CEBPB共同结合一个的DNA区域内调节基因的表达,这有待于经典的生物学进一步验证。结论：SOX2在结肠癌组织的细胞核中的表达显著高于正常组织。SOX2基因干涉降低了结肠癌细胞的体外增殖能力和体内致瘤能力,细胞周期呈现S和G2／M期阻滞。SOX2基因干涉后数条与结肠癌发生相关的生物过程中的基因表达下调。确定了SOX2在基因组上的结合位点和结合特征；SOX2在肿瘤细胞中和人胚胎干细胞中共有372个共同的基因组结合位点,说明Sox2在肿瘤中和在胚胎中对基因的调节具有一定的保守性；基因芯片数据和Chip-seq数据整合分析确定了SOX2可能直接调节94个基因的转录,其中53个基因受SOX2的正调节,41个受SOX2的负调节。蛋白相互作用分析显示SOX2与HNRNP家族蛋白相互结合,这种相互结合可能共同参与了基因表达的调节。因此,本研究为我们深入了解SOX2基因在肿瘤中作用的分子机理提供研究基础和线索。