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猪肺炎支原体(Mycoplasma hyopneumoniae, Mhp)通过黏附于猪呼吸道纤毛上皮细胞而进行感染,可刺激机体黏膜免疫系统产生相应的抗体,其中分泌型IgA (SIgA)是主要的效应因子,在黏膜免疫中起着重要作用。本研究通过包被抗原Mhp P97R1蛋白,酶标二抗羊抗猪IgA-HRP检测猪黏膜黏液中特异性SIgA抗体,对Mhp进行临床监测,评价猪的免疫状态和疫苗的黏膜免疫效果。实验筛选7头2月龄健康猪,气管注射Mhp组织强毒,ELISA法检测在攻毒后第1、2、4、6、8、12、16和21天试验猪鼻拭子中抗Mhp P36、P46、P97R1的特异性SIgA抗体滴度,经鼻拭子总蛋白浓度校准,比较3种特异性SIgA抗体在感染后21d内的分泌规律。结果显示,在感染后第6天,呼吸道中抗Mhp P36、P46、P97R1的3种特异性IgA抗体分泌量均开始上升,于感染后第12天达到高峰,并持续到实验结束(第21天),且同一天内3种特异性IgA抗体之间的分泌量差异不显著(P>0.05),表明在Mhp感染的早期阶段,P36、P46、P97R1蛋白均可诱发猪呼吸道产生特异性IgA抗体,且分泌量与分泌规律较为相似,差异不显著。根据Mhp的致病机理,以及主要抗原蛋白的研究背景,本实验选择Mhp黏附蛋白P97R1作为SIgA-ELISA试剂盒的包被抗原。确定包被抗原后,利用实验室保存的P97R1阳性质粒,大肠杆菌表达系统表达P97R1蛋白,用亲和层析进行纯化,通过SDS-PAGE、Western-blotting鉴定,获得了Mhp种特异性蛋白P97R1。对P97R1蛋白的制备方法进行优化与标准化,确保试剂盒所用抗原的特异性与稳定性。通过对SIgA-ELISA试剂盒各试剂中保护剂的筛选,根据ELISA检测条件,确定了试剂盒生产工艺,并组装三批试剂盒。经对健康猪、自然发病猪、人工发病猪以及免疫猪的鼻拭子样本进行检测,确定阴阳性界定值为0.261；通过对150份临床阳性样品检测,敏感度为95.1%,且对强阳性样品最低检出量的稀释度为1：160,对弱阳性样品最低检出量的稀释度为1：80；通过对87份阴性样品检测,特异性为92.3%,且与猪鼻支原体、猪絮状支原体之间无交叉反应。重复性试验发现,试剂盒孔间变异系数为3.1%-8.76%,批内变异系数为4.26%-8.06%,批间变异系数4.64%-14.5%。保存期试验证实组装好的试剂盒可在4℃条件下保存6个月以上。分泌片(SC)为SIgA的组成部分,检测SC可以更好的反应SIgA水平,排除其他免疫球蛋白的干扰。实验通过凝胶过滤层析、离子交换层析从猪初乳中纯化猪分泌片SC蛋白,以纯化的猪SC蛋白为抗原免疫4周龄BALB/c小鼠,制备鼠抗猪SC蛋白单克隆抗体。得到1株能稳定分泌抗SC蛋白抗体的杂交瘤细胞株,命名为2A6。Western Blot分析,2A6能与SC蛋白产生反应,与猪IgG蛋白无交叉反应。采用间接ELISA测得2A6腹水与SC蛋白的反应效价为1：204800。