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[目的]
研究促炎物质对单核细胞IL-37及Smads信号通路分子表达的影响,对IL-37的抗炎作用可能机制进行初步探讨。
[方法]
1.分离获取健康人外周血单个核细胞(PBMCs),分别用TNF-α和LPS作用PBMCs进行促炎物质的刺激实验,以未予促炎物质刺激的PBMCs为对照组,分别用TNF-α和LPS作用PBMCs0.5 h、1h、4h、8h,然后分别用实时荧光定量PCR进行检测IL-37及Smads和NF-κB信号通路分子的表达水平。另外,分别用1 ng/ml~100 ng/ml等不同浓度的TNF-α和0.01μg/ml~10μg/ml等不同浓度的LPS刺激PBMCs,用实时荧光定量PCR进行检测促炎物质不同浓度作用PBMCs后,其IL-37及Smads和NF-κB信号通路分子表达水平的变化。
2.用佛波酯(PMA)诱导单核细胞THP-1分化为巨噬样细胞,以之为靶细胞进行促炎物质的相关刺激实验,以未予促炎物质促炎物质刺激的细胞为对照组,分别用TNF-α和LPS作用THP-16h、12h、24 h,然后分别用实时荧光定量PCR进行检测IL-37表达及Smads和NF-κB信号通路分子的表达水平。另外,分别用1 ng/ml~100 ng/ml等不同浓度的TNF-α和0.01μg/ml~10μg/ml等不同浓度的LPS刺激THP-1,用实时荧光定量PCR检测IL-37及Smads和NF-κB信号通路分子表达水平的变化。
[结果]
1.TNF-α、LPS对PBMCs IL-37表达的影响。分别用促炎物质TNF-α、LPS刺激PBMCs后,实时荧光定量PCR检测结果显示,PBMCs经30 ng/ml TNF-α作用0.5 h、1h、4h、8h等不同时间后,IL-37 mRNA的表达水平逐渐升高。当TNF-α刺激PBMCs4 h后,其IL-37 mRNA的表达水平与对照组比较具有显著的差异(P<0.05)。PBMCs经1μg/ml LPS作用0.5 h、1h、4h、8h等不同时间后,IL-37 mRNA呈上升表达。当LPS刺激PBMCs1 h时,其IL-37 mRNA的表达水平与对照组比较具有显著差异(P<0.05);作用4h、8h时,其IL-37 mRNA的表达水平与对照组比较,则具有非常显著的差异(P<0.01),并随着刺激时间的延长,IL-37 mRNA的水平呈继续上升表达。不同浓度促炎物质刺激PBMCs后的检测结果显示,IL-37的表达水平随着TNF-α和LPS作用浓度的升高,IL-37的表达水平逐渐上升。当TNF-α浓度为30 ng/ml时,IL-37表达至最高水平,高于该作用浓度后,IL-37的表达水平未见明显升高;当LPS浓度为1μg/ml时,IL-37表达至最高水平,随着LPS作用浓度的继续增加,IL-37的表达水平则未见明显升高。
2.LPS对PBMCs Smads信号通路分子表达的影响。当用1μg/ml LPS作用PBMCs0.5 h、1h、4h、8h等不同时间后,实时荧光定量PCR结果显示,当LPS分别作用PBMCs0.5 h、1h、4h时,Smad2的表达呈上升趋势,而作用8h时则有所下降;Smad3的表达水平也随着作用时间的增高而逐渐升高,作用4h时,其表达水平与对照组相比较才具有显著差异(P<0.05); Smad7的表达则在LPS作用PBMCs1 h时就显著升高,与对照组相比较具有显著差异(P<0.05),当LPS作用分别上升至4h、8h时,Smad7表达水平的升高与对照组相比较具有非常显著升高(P<0.01)。
3.LPS对PBMCs NF-κB信号通路分子表达的影响。当用LPS(1μg/ml)刺激PBMCs0.5 h、1h、4h、8h等不同时间,实时荧光定量PCR结果显示,LPS作用PBMCs8 h时,NF-κB P65表达水平升高与对照组相比较具有显著差异(P<0.05);在LPS作用PBMCs0.5 h至8h时,IκBα的水平均呈明显升高,与对照组相比较都具有显著的差异(P<0.05);当LPS作用PBMCs0.5 h~1 h时,IKKβ的表达水平与对照相比较均具有显著的差异(P<0.05),当作用4h时,则具有非常显著的差异(P<0.01),当8h时其表达水平有所下降,但与对照组相比较仍具有显著差异(P<0.05)。而LPS作用PBMCs后,IKKα表达尽管有所升高,但与对照组相比较,无统计学意义(P>0.05)。
4.TNF-α、LPS对THP-1 IL-37表达的影响。THP-1经PMA诱导分化成巨噬细胞后,分别用TNF-α和LPS进行刺激实验。实时荧光定量PCR结果显示,当用30 ng/ml TNF-α作用THP-1后,IL-37 mRNA的表达水平逐渐升高,至作用12h时,其IL-37 mRNA的表达水平与对照组相比较,具有非常显著的差异(P<0.01),作用24 h时达最高峰。另外,当用不同浓度的TNF-α处理THP-1细胞的检测结果显示,当TNF-α浓度为30 ng/ml时,IL-37表达水平达到最高,之后,IL-37的表达水平并没有随着TNF-α作用浓度的继续增高。当用1μg/ml LPS刺激THP-1后,IL-37 mRNA水平呈上升表达,作用12h、24 h与对照组相比具有显著差异(P<0.05)。当用不同浓度的LPS处THP-1理细胞,结果显示,当LPS浓度为1μg/ml时,IL-37表达至最高水平,然后IL-37的表达水平并没有随着LPS作用浓度的继续增高。
5.TNF-α对THP-1 Smads信号通路分子表达的影响。THP-1经PMA诱导分化成巨噬细胞后,用TNF-α进行刺激实验。实时荧光定量PCR结果显示,当用TNF-α(30 ng/ml)刺激6h、12h、24 h等不同时间后,只有刺激24 h时Smad2、Smad3 mRNA的表达水平明显升高,与对照组相比较具有显著差异(P<0.05)。而Smad7的表达水平则在TNF-α作用THP-112 h时就呈显著升高(P<0.05),当作用24 h时,Smad7的mRNA表达水平与对照组相比较则具有非常显著差异(P<0.01)。
6.TNF-α对THP-1 NF-κ B信号通路分子表达的影响。THP-1经PMA诱导分化成巨噬细胞后,用TNF-α进行刺激实验。实时荧光定量PCR结果显示,经TNF-α(30 ng/ml)刺激THP-16h、12h、24 h等不同时间后,NF-κB P65表达水平逐渐升高,但在作用24 h时,NF-κ B P65的表达水平与对照组相比较具有显著差异(P<0.05)。IκBα的表达水平在TNF-α作用THP-1后有所升高,至作用24 h时,其表达水平的升高与对照组相比较具有非常显著的差异(P<0.01)。IKKα和IKKβ的表达水平在TNF-α作用THP-1后也呈上升表达,但只有在作用24 h时,二者的表达水平与对照组相比较才具有显著的差异(P<0.05)。
[结论]
TNF-α和LPS等促炎物质能够上调单核细胞IL-37,同时Smad2、Smad3、Smad7等Smads信号通路分子也呈上调表达且与IL-37上调表达趋势基本一致,提示IL-37可能通过Smads信号通路发挥抗炎作用,将为进一步研究IL-37的抗炎作用机制提供一定的实验依据。