论文部分内容阅读
近年来,随着经济发展,生活污水和工业废水的排放量不断提高,地下水中的氮污染程度愈来愈严重。在冬季持续时间较长的寒冷地区,地表水的水温长期保持在0-2℃左右,传统的以自养硝化菌为核心的生物脱氮工艺难以对低温水体中的氮污染进行去除。相比于自养硝化细菌,异养细菌具有更优秀的环境适应能力,在低温下能保持较高的生长和代谢速率。本研究致力于筛选出具有高效脱氮性能的耐冷异养菌,对其脱氮性能进行全面考察,利用分子生物学技术深入探究其低温脱氮机制。新型耐冷脱氮菌的研究丰富了低温低污染水体处理手段,对寒冷地区的饮用水保障具有重要的意义。本研究从低温生物滤池的滤料中筛选出一株耐冷脱氮菌株M-11。通过形态观察,BIOLOG分析等手段及遗传学特征对M-11菌株进行鉴定,并考察多种环境因素对其脱氮性能及生长速率的影响。鉴定结果表明,该菌株为詹森菌属(Janthinobacterium),2℃下35小时内能够对低浓度氨氮(5mg/L)实现98%以上的去除并伴有1mg/L氧化亚氮的生成。M-11菌株适合在中性及弱碱性条件下生长,适宜的碳源(丙三醇和葡萄糖)和较高的碳氮比有助于提高氨氮的去除效率。M-11菌株属于兼性厌氧菌,但厌氧条件下菌株生长和脱氮效率均受到一定抑制。厌氧条件下,M-11菌株的硝化过程基本停滞,细菌同化成为氨氮去除的主要途径。不同于已报道的好氧反硝化菌,M-11菌株在硝酸盐氮的好氧反硝化中并没有产生亚硝酸盐氮积累。相反在厌氧条件下,由于硝酸盐氮的转化效率提高,M-11菌株在进行厌氧硝酸盐氮反硝化过程中产生较为明显的亚硝酸盐氮积累。同时,在厌氧条件下,反硝化过程中氧化亚氮的生成量明显上升。全基因组测序结果表明,M-11菌株基因全长6,394,979bp,GC含量为62.36%,序列中存在两段CRISPR序列。COG,KEGG及GO功能注释结果表明M-11菌株的功能基因种类及数量均超过已报道的低温异养菌。M-11的基因序列中共含有34个基因岛,包含Tra C、Tra E及Tra L等多个可编码接合转移蛋白的功能基因。与NCBI数据库中五株詹森菌属菌株的共线性分析结果证明,M-11菌株与Janthinobacterium菌属中svalbardensis种菌株基因组具有最高的相似性。M-11菌株基因组中含有3个冷激蛋白编码基因,6个热激蛋白编码基因,能够提高M-11菌株对寒冷条件的适应能力。同时M-11基因序列中包含18个能够编码天冬氨酸,甘氨酸及甲硫氨酸等常见抗冻蛋白的功能基因,这些抗冻蛋白能够降低细胞催化过程所需催化能,进一步提高细菌在低温下的活性。不同温度下转录组结果显示,当温度从2℃上升至25℃时,基因表达差异性显著,上调基因数为122个,下调基因数为58个,热激蛋白基因表达量上调,防止蛋白因温度上升而凝结。低温条件下,趋化性相关基因模块表达明显,说明M-11菌株通过向有利于菌体生长的营养物环境移动,以提高其在低温条件下的生长和代谢速率。不同温度下运输蛋白相关基因表达差异性较大,说明M-11菌株能够通过改变运输蛋白种类保持其在低温条件下与外界环境正常的物质交换。当温度从25℃下降至2℃,M-11菌株细胞膜中不饱和脂肪酸和长链脂肪酸比例上升,降低了细胞膜整体的熔点,保持细胞膜在低温条件下的流动性和选择透过性。通过氮代谢通路分析和氨单加氧酶编码基因amo A的扩增结果发现,厌氧环境对于氨单加氧酶的抑制作用是M-11菌株硝化过程停滞的根本原因。在M-11菌株中同时扩增出可编码周质硝酸盐还原酶的基因nap A和厌氧硝酸盐还原酶的基因nar G,结合反硝化代谢通路可知,硝酸盐氮厌氧反硝化过程中,nar G基因优先表达,加快M-11菌对硝酸盐反硝化速率,因此产生了明显的亚硝酸盐积累。M-11菌株中的反硝化酶在好氧条件下受到溶解氧的抑制,导致反硝化效率下降,是好氧反硝化过程中氧化亚氮生成量降低的根本原因。连续流反应器结果表明,M-11菌株能够有效提高反应器对低温水体中氨氮的去除能力。连续运行80天后,接种菌种的反应器的氨氮浓度从1mg/L下降至0.6mg/L左右,而对照组无生物接种的反应器去除效率仅有8%。微生物群落结构结果表明,Janthinobacterium菌属成为了反应器中微生物系统中的优势种群,同时M-11菌株提升了反应器整体的生物群落多样性和生物量,提高了反应器内部微生物系统的稳定性。