叶黄素(Lutein)作为一种天然色素,广泛存在于高等植物和藻类生物中。由于它具有较强的抗氧化和着色能力,因此,它的应用广泛,市场需求日益扩大,现有的资源已经不能满足日益扩大的市场需求,开发研究叶黄素新资源已经成为当前的热点。研究发现,小球藻是一种极具潜力的叶黄素源,与其它叶黄素源相比,小球藻具有生长快速、可进行异养和混养培养、合成游离叶黄素等优势。目前关于提高小球藻中叶黄素产量的研究,主要是优化培养条件和改良提取工艺,但是,这些方法已经遭遇瓶颈,难以继续大幅度提高叶黄素产量,因此,需要寻找新的方法来实现叶黄素产量的继续增加。基因工程技术的发展为这一目标的实现提供了可能。本研究以实验室前期筛选出的一株高产叶黄素的藻株,即原壳小球藻(Chlorella protothecoides)CS-41为研究对象,探索叶黄素生物合成途径中几个关键基因的功能,研究环境因子对关键基因表达调控的影响,并尝试建立小球藻的遗传转化体系,试图改造其叶黄素生物合成途径来达到提高叶黄素产量的目标。得到了以下结果:1、克隆了C.protothecoides CS-41叶黄素合成途径中编码八氢番茄红素合成酶的基因(psy),该基因全长2488 bp,对应的c DNA长1143 bp,编码380个氨基酸。Southern blot分析结果表明,psy在该藻株中为单拷贝。采用Gendoc软件以及在线Blast比对分析发现,来自原壳小球藻的PSY属于Isoprenoid_Biosyn_C1亚家族,含有三个底物Mg2+结合位点(DXXXD)。从构建的生物进化树可以看出,该基因编码的氨基酸序列与其它绿藻类以及高等植物对应的序列均具有很高的相似性,在进化系统中维持高度的保守性。对psy基因的原核表达分析结果表明,原壳小球藻的PSY能够催化GGPP合成八氢番茄红素。采用基因组步移技术克隆了C.protothecoides CS-41 psy基因启动子序列,并对其进行了预测和分析。将启动子序列融合gus基因瞬时转化烟草悬浮细胞,并检测GUS酶活性,结果表明,psy基因上游-774 bp具有较强的启动转录活性。荧光定量PCR分析结果表明,甲基茉莉酸能诱导psy基因的表达,可能与启动子中含有甲基茉莉酸应答元件有关。2、采用农杆菌介导的转化方法将C.protothecoides CS-41的psy基因转入到高等植物生菜中,通过常规PCR和半定量RT-PCR证实了psy基因的插入和表达,最终得到了7株阳性的转基因生菜植株;采用高效液相色谱分析了转基因生菜中的叶黄素含量,发现大部分转基因生菜中的叶黄素含量均高于对照非转psy基因的生菜,最高的含量可达到野生型生菜的1.8倍。由于C.protothecoides CS-41的psy基因与衣藻的亲缘关系很近,将该psy基因转入衣藻psy基因突变体中,结果表明,该psy基因的表达能互补衣藻的八氢番茄红素合成酶的功能,使衣藻突变体恢复了在光下存活的能力,并呈现绿色表型。3、对C.protothecoides CS-41的八氢番茄红素脱氢酶基因(pds)进行了原核表达分析,将带有pds基因的表达载体p UC-pds与p AC-EB共同转入大肠杆菌JM109中,诱导表达后,菌体由诱导前的无色变成了浅黄色,在菌体中检测到了八氢番茄红素的脱氢产物—ζ-胡萝卜素,证明了来自原壳小球藻的PDS能高效催化八氢番茄红素的脱氢反应,生成下一步产物。此外,采用随机突变和定点突变的方法发现了第430位碱基(对应第144位氨基酸)是PDS活性的一个关键位点,该位点的突变会导致这个酶活性的完全丧失。克隆了pds基因的启动子,并对其进行了序列分析和元件预测,发现其中含有一些光诱导元件,也含有甲基茉莉酸应答元件,但是甲基茉莉酸并不能诱导pds基因表达,反而使pds基因的表达量下降。4、分别研究了氯化钠(Na Cl)、脱落酸(ABA)和光照对C.protothecoides CS-41生长及其类胡萝卜素合成途径中关键酶基因表达的影响。研究结果表明,低于300m M的Na Cl处理对C.protothecoides CS-41的细胞增殖有所抑制,但不显著,而高于600 m M则严重影响了藻细胞的生长;Na Cl的添加会使小球藻细胞聚集成团,细胞壁加厚,细胞内积累较多的脂质;从基因表达水平上来看,不同浓度Na Cl的处理对psy、pds、ζ-胡萝卜素脱氢酶基因(zds)以及番茄红素ε环化酶基因(lcye)的表达影响不大,而对玉米黄质环氧化酶基因(zep)的表达则有促进作用。从叶黄素合成量来看,300 m M及以下浓度的Na Cl处理能使叶黄素含量提高,而高于300 m M,叶黄素的含量会下降。在培养基中添加外源ABA培养小球藻,各测试基因的表达量均下降。光照条件对类胡萝卜素合成途径中各关键酶基因的表达都有不同程度地促进,特别是psy基因的表达在光的诱导下明显上调。5、为了摸索建立小球藻的遗传转化体系,更好地研究这些基因的功能,选择了叶绿体基因组全测序的普通小球藻(Chlorella vulgaris)C-27作为研究对象,根据C.vulgaris C-27的叶绿体基因组信息,选择了trn L和psb H两个基因之间的空隙,将编码O腺苷酸转移酶基因(aad A)表达盒插入到它们之间,尝试建立小球藻的叶绿体遗传转化体系,通过采用基因枪转化方法进行转化,得到了一些抗性藻株。