多细胞管是生物体内几乎所有内部器官的基本组成单位,其发育或功能缺陷通常会导致疾病的发生,例如结肠癌和多囊肾病等。多细胞管是由极化的上皮细胞组成。上皮细胞的顶端膜围绕中央的管腔形成管腔膜,基底侧膜与相邻细胞或细胞外基质接触。尽管多种调控上皮细胞极性的因素已经被发现,但它们在上皮细胞极性建立、极化膜生物合成和组织形成过程中是如何相互协调和整合的还尚不清楚。目前一种观点认为在细胞外的极化信号发生后,上皮细胞的顶端-基底端膜结构域是由细胞膜和细胞连接相结合的极性决定因子(如PAR复合物、Crumbs复合物和Scribble复合物)建立的,随后由细胞内的定向/极性运输来维持。然而这一观点却无法合理解释细胞极性决定因子本身是如何到达不同的膜结构域的,并且这一观点目前受到了来自对体外和体内3D管腔化研究结果的挑战。最近,据报导在对体外3D组织培养的MDCK细胞和秀丽线虫肠道上皮细胞的管腔化研究中发现囊泡运输对于顶端/管腔膜结构域的极化定位是必需的,并且细胞内的囊泡运输本身能决定膜结构域的特性,可能通过在新的膜生物合成过程中招募和运输极性决定因子到达其相应的膜结构域。本实验室的前期研究结果表明与囊泡相结合的鞘糖脂、网格蛋白及其衔接蛋白AP-1的缺失会导致包括极性决定因子在内的多种顶端膜蛋白错误地出现在秀丽线虫肠道上皮细胞的基底侧膜,并导致异位侧腔的形成。由此说明鞘糖脂、网格蛋白和AP-1参与顶端膜蛋白的分选,并且证实了鞘糖脂在早期关于极性的脂质筏假说中的作用。此外,在秀丽线虫肠道顶端膜结构域和管腔的极性定位过程中,网格蛋白和它的衔接蛋白AP-1都与鞘糖脂有遗传的相互作用,说明这些囊泡载体结合因子是秀丽线虫肠道管状上皮细胞顶端膜极性的固有调控因子,并且支持了鞘糖脂在顶端膜生物合成过程中的一种假定的囊泡分选模型,即鞘糖脂、网格蛋白及其衔接蛋白AP-1共同作用将带有顶端膜蛋白的运输囊泡分离出来并定向地运往顶端细胞膜。尽管以上的体内实验结果支持了囊泡运输是细胞发生极化的固有调控因素,但鞘糖脂/网格蛋白/AP-1依赖的运输通路是如何指导顶端细胞膜极性建立的,包括哪些分子参与调控这一通路,以及这一通路是通过哪种途径将顶端膜蛋白运输到顶端膜结构域的还不清楚。本研究以秀丽线虫后有丝分裂期延伸的肠道管状上皮细胞为模型,对鞘糖脂依赖的顶端极性分选途径的囊泡运输调控因子及其调节路径进行了研究。首先,对秀丽线虫多细胞肠道和单细胞排泄管的顶端膜生物合成和管腔化过程缺陷分别进行了基因组范围内的rnai筛选,结果从中获得了50个与囊泡运输相关的基因,包括囊泡包被复合物copi/copii的组成成分、小gtp酶、v-atp酶组成成分和snare蛋白等的编码基因。这些基因几乎涵盖了与囊泡运输有关的各个过程,包括囊泡的生物合成、运输、锚定和融合。由于这50个基因的缺失都会导致管状上皮细胞顶端膜蛋白极化定位的缺陷,因此这些基因对于顶端膜的生物合成是必需的。其次,为了研究这50个与囊泡运输相关基因中是否有调节鞘糖脂依赖的顶端分选途径的基因,本研究对这50个基因和一个编码鞘糖脂生物合成酶的基因let-767之间做了遗传相互作用的筛选,结果成功获得了鞘糖脂依赖的顶端分选途径的调控基因,包括12个鞘糖脂依赖的极性转换表型的增强子(增强子是指那些功能缺失后能导致let-767(+/-)突变虫株中出现极性转换表型的基因)和5个抑制子(抑制子是指rnai后能减少带有极性转换表型的let-767(-/-)秀丽线虫数目的基因)。随后的分析发现在这些囊泡运输相关分子中,增强子主要在分泌/生物合成途径中起作用,并且其中大部分因子调控er-golgi之间的运输途径。相反,抑制子则主要在内吞循环途径中起作用,它们主要调控golgi到质膜之间的运输途径。此外,增强子本身对于顶端膜蛋白的分选是必需的,说明顶端膜结构域的延伸和定位伴随着分泌/生物合成途径而发生。通过对抑制子的抑制机理研究发现,抑制子的缺失并不会导致极性的恢复,而是通过减缓顶端膜蛋白向基底侧膜的错误运输来抑制由鞘糖脂缺失所导致的极性转换表型的出现。最后,采用rna干扰和体内观察实验对三个抑制子-dab-1/disabled,rab-7和vha-6(v-atpase的组成成分)的功能缺失进行研究,结果表明这三个抑制子对顶端膜和基底侧膜的生物合成都是必需的,并且这些抑制子是在鞘糖脂依赖的分选位点上游起作用,通过调控顶端膜蛋白和基底侧膜蛋白的内吞循环来调控鞘糖脂依赖的顶端分选途径。综上,本研究成功获得了17个鞘糖脂依赖的顶端极性分选途径的囊泡运输调控因子(包括12个增强子和5个抑制子)。其中增强子调控分泌/生物合成途径,可能在鞘糖脂依赖的顶端运输途径或与其相平行的途径中起作用,而抑制子则调控内吞循环途径,将内吞后的顶端膜蛋白和基底侧膜蛋白运输至鞘糖脂依赖的分选位点。本研究结果进一步支持了鞘糖脂依赖的顶端运输通路在顶端细胞膜生物合成过程中所起的作用是基于囊泡运输的分选机制,同时也支持了生物合成途径固有地定向分化细胞膜极性的观点,并为今后深入研究囊泡运输在极化膜生物合成和上皮细胞极性建立过程中的作用机制提供了依据,也为深入研究相关疾病的发生机制和防治提供了重要参考。