目的：三维（3dimensional,3D）球形培养和ROCK抑制剂对提高细胞活性和增殖有促进作用，本研究的目的是探索细胞球形培养和新型ROCK抑制剂Y-39983形成一种高活性生物打印，并探究高活性生物墨水应用于3D生物打印，以及在利用胶原膜构建一种角膜上皮细胞片。　　方法：提取兔眼角膜上皮细胞，采用256孔硅胶模具制作琼脂糖模型进行球形培养，并利用细胞死活染色和EdU染色评估Y-39983对兔角膜上皮细胞球的活性以及增殖的影响，同时用免疫荧光、qPCR和Western blot的方法检测其细胞表型和细胞功能是否发生改变。用自行研制的3D打印装置将角膜上皮细胞球打印在胶原膜上，用ROCK抑制剂Y-39983促进细胞展开成片，利用光镜观察记录展开面积与成片时间，用免疫荧光检测其细胞表型及细胞衰老SA-β-Gal染色检测其凋亡情况，用电子扫描显微镜观察角膜上皮细胞片表面超微结构。　　结果：细胞死活染色显示0.3μM Y-39983培养的兔角膜上皮细胞球死细胞率最少（4.76%±3.83%），兔角膜上皮细胞悬液组和兔角膜上皮细胞球组死细胞率分别为（42.36%±16.20%）和（19.36%±1.51%）（P＜0.05，n=3）三组数据有统计学意义。EdU染色实验结果显示0.3μM Y-39983加球形培养组的细胞增殖率在三个组中最高(20.25%±1.34%)，细胞悬液组和球形组增殖率分别为（8.55%±2.12%）和（3.285%±3.01%）（P＜0.05，n=3），三组数据有统计学意义。免疫荧光染色表明球形培养加0.3μM Y-39983的兔角膜上皮细胞表达角膜上皮细胞标志蛋白CK3，并表达蛋白Vimentin，且qPCR显示球形培养可增加兔角膜上皮细胞角膜缘干细胞相关基因ABCG2、ΔNp63α及Nestin表达，Western blot显示球形培养可使兔角膜上皮细胞蛋白p63α和CK3表达增加。使用3D生物打印装置用RCEC细胞球在胶原膜上打印3×3总共9个点，两点距离为0.5cm，液滴大小为8μl，用时大约10分钟。加0.3μM ROCK抑制剂Y-39983可使兔角膜上皮细胞球在第7天展开成片，免疫荧光显示细胞成片后表达角膜缘干细胞标志蛋白ABCG2与p63α以及角膜上皮细胞标志蛋白CK3和E-Cadherin，细胞衰老SA-β-Gal染色显示加0.3μM Y-39983后培养在胶原膜上的衰老细胞染色率最低（19.00%±4.20%），球形培养组和细胞悬液组衰老细胞染色率分别为（43.00%±5.70%）和（78.50%±2.10%）（P＜0.05，n=3），三组数据有统计学意义，电镜显示胶原膜上细胞分泌细胞外基质并相互连接。使用3D生物打印装置用RCEC细胞球在胶原膜上打印3×3总共9个点，两点距离为0.5cm，液滴大小为8μl，用时大约10分钟。加0.3μM ROCK抑制剂Y-39983可使兔角膜上皮细胞球在第7天展开成片，免疫荧光显示细胞成片后表达角膜缘干细胞标志蛋白ABCG2与p63α以及角膜上皮细胞标志蛋白CK3和E-Cadherin，细胞衰老SA-β-Gal染色显示加0.3μM Y-39983后培养在胶原膜上的衰老细胞染色率最低（19.00%±4.20%），球形培养组和细胞悬液组衰老细胞染色率分别为（43.00%±5.70%）和（78.50%±2.10%）（P＜0.05，n=3），三组数据有统计学意义，电镜显示胶原膜上细胞分泌细胞外基质并相互连接。　　结论：我们的研究结果表明通过球形培养结合ROCK抑制剂Y-39983，可以促进兔角膜上皮细胞活性和增殖，保持角膜上皮细胞原有表型并增加了角膜缘干细胞相关基因和蛋白表达，为3D生物打印提供一种高活性生物打印墨水。在胶原膜上3D打印兔角膜上皮细胞球并加0.3μM Y-39983培养可在第7天展开成片，细胞表达角膜缘干细胞标志蛋白ABCG2与p63α以及角膜上皮细胞标志蛋白CK3和E-Cadherin，并且降低细胞衰老，形成细胞间紧密连接的角膜上皮片。