论文部分内容阅读
目的:表皮生长因子受体EGFR具有酪氨酸激酶活性,是一种重要的跨膜受体,是细胞生长、分化和存活的重要调节因子。EHD2蛋白是一类新型膜转运调控蛋白。前期研究工作显示,EHD2降表达使乳腺癌细胞EGFR总量下降,并抑制了乳腺癌细胞的生长和迁移能力,但EHD2是否调控EGFR的转运和信号传导还不清楚。本课题将在应用宫颈癌Hela细胞为模型研究EHD2对EGFR的转运调控的基础上,进一步验证由此对细胞增殖、迁移、转化及成瘤性的影响,并初步检测EHD2在实体乳腺瘤中的表达和定位情况,以探讨EHD2以及它对EGFR的调控作用在肿瘤发生发展中的作用机制。方法:1.通过Western Blotting和免疫荧光技术分别验证内源性EHD2在Hela细胞中的表达和定位情况。2.建立稳定感染空载体,稳定感染EHD2降表达的Hela细胞。用Westem Blotting技术验证EHD2降表达效果及对EGFR表达情况的影响,并用有限稀释法获得EHD2蛋白表达下降明显的克隆。3.通过Western Blotting检测EHD2降表达后EGF刺激下Hela细胞EGFR的降解速率及EGFR,AKT的磷酸化水平。4.采用细胞计数法检测EHD2降表达对Hela细胞增殖能力的影响。5.趋化运动实验,探讨EHD2降表达对Hela细胞的运动能力影响。6.Soft Agar实验,探讨EHD2降表达对Hela细胞克隆生长能力的影响。7.体内实验检测EHD2降表达对Hela细胞在SCID鼠体内成瘤能力的影响。8.用Western Blotting和免疫组化的方法检测EHD2在乳腺癌组织中的表达情况。结果:1 Hela细胞中EHD2有适度的表达,并且在核,浆,膜中均有定位。2应用siRNA经慢病毒体系感染Hela细胞后,Western检测EHD2蛋白表达明显下降,同时EGFR蛋白含量总体上下降。3 EHD2降表达后EGF刺激下Hela细胞EGFR的降解速率加快,EGFR在Tyrl068和AKT在Thr-308位点的磷酸化水平减弱。4 EHD2降表达后Hela细胞的增殖能力减弱(P<0.01)。5与对照组相比,EHD2降表达的Hela细胞的趋化运动能力明显减弱(P<0.01)。6与对照组相比,EHD2降表达的Hela细胞克隆生长能力减弱。7与对照组相比,EHD2降表达促进了 Hela细胞在SCID鼠中的生长。8 Western Blotting和免疫组化检测发现EHD2在正常乳腺组织中表达高于乳腺癌组织。结论:1.内源性EHD2负调控Hela细胞EGFR内吞并抑制随后的降解,而EHD2干扰表达可加快EGFR的内吞并使EGFR总量下降。2.细胞实验发现EHD2干扰对细胞功能(生长,定向迁移等)的影响与干扰后EGFR受体的表型一致,表明EGFR依赖的细胞主要功能可以通过EHD2来调节。3.EHD2降表达促进了 Hela细胞在SCID鼠中的生长,并且EHD2在乳腺癌组织中低表达。4.肿瘤的发生发展是受多因素影响的,EHD2的作用机制尚需进一步的研究。