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抗菌肽作为天然免疫系统中一个重要成员在清除病原体感染时发挥着重要作用。本实验室在构建大海马雄性孵化袋cDNA文库时发现的一种抗菌肽基因编码的蛋白,通过序列比对发现与来自猪蛔虫假体腔的ASABF抗菌肽有一定的序列相似性(45%),而命名为HKABF。我们尝试用基因工程蛋白重组的方法获得较多量的目的蛋白,以证实这一抗菌肽的功能并为以后的深入研究做准备。
在实验室前期工作中,通过用pTRX载体融合表达的方法在大肠杆菌E.coliBL21(DE3)中表达,但最终没有获得有活性的目的蛋白。另外也尝试用酵母直接进行分泌表达,虽然结果显示此蛋白是有抗菌活性的,但是发生了基因沉默现象,导致筛选出的表达菌株不能稳定遗传。这可能与目的蛋白对宿主本身的毒害作用有关。本研究主要是通过在原海马抗菌肽的成熟肽N端融合一段前体肽中富含酸性氨基酸的pro-region序列,这段酸性肽能够中和海马抗菌肽成熟肽的强碱性而减弱其对宿主本身的毒害作用,然后在毕赤酵母中以融合蛋白的形式分泌表达。通过这种方式,融合蛋白能够在酵母中高效表达并且由于在设计目的蛋白表达基因时加入了6His标签而可以直接用Ni2+柱对融合蛋白进行纯化。获得的融合蛋白没有抗菌活性但是当用Enterokinase蛋白酶酶切后就具有明显的抗菌活性。
通过纯化我们最终获得了15mg/L的目的蛋白HKABF,利用这些蛋白我们对这一抗菌肽作了一些理化性质研究。包括抗菌活性,热稳定性,酸碱稳定性,盐浓度对活性的影响,溶血性,色谱纯度鉴定以及二级结构的测定等。结果表明重组HKABF能够在比较低的浓度下就能抑制金黄色葡萄球菌和白葡萄球菌的生长,MIC分别为0.5mg/ml和2.5mg/ml。重组HKABF有很强的热稳定性和酸碱稳定性,溶血性很低,其活性不受NaCl和KCl高盐浓度的影响,但是其在仅15mM的CaCl2盐浓度下活性就完全受到抑制。利用反向高效液相色谱鉴定纯化的重组HKABF,其色谱纯度达85%以上。圆二色谱测定其二级结构可以将其归为CSaβ型抗菌肽。
以上结果可以说明通过将酸性氨基酸融合到成熟抗菌肽上来进行抗菌肽的重组表达是一种有效的表达方式,可以广泛应用于其他类似抗菌肽的表达。同样本研究也可以说明本实验室发现的这种海马抗菌肽在海马孵化袋中可能发挥着重要的天然免疫功能。本研究为此类抗菌肽在以后更深入的研究以及应用前景上奠定了很好的基础。