研究背景心肌梗死(myocardial infarction,MI)后心肌重塑是影响患者预后的关键因素。心肌重塑涉及多个病理生理过程,其中包括：心肌细胞的凋亡和肥大,血管新生以及细胞外基质的合成和沉积。MI早期,心肌成纤维细胞在细胞因子的作用下,被招募到损伤区域,合成和分泌大量以胶原为主的细胞外基质,取代损伤坏死的心肌组织,稳定心脏结构,防止心脏破裂。然而,过度的细胞外基质沉积,在远期则会引起心肌纤维化,导致心室顺应性降低,严重影响心脏的收缩和舒张功能,最终造成心力衰竭。除此之外,心肌纤维化还可导致心肌电生理重构,诱导室性心律失常的发生,严重影响患者预后及生活质量。因此,如何调控心肌纤维化的进程,成为改善心肌梗死后患者预后的关键因素。肾素-血管紧张素-醛固酮系统(renin-angiotention-aldosterone system, RAAS)在MI后心肌重塑中起着十分重要的作用。AngⅡ是RAAS系统的主要活性物质。研究表明,MI患者心肌组织中血管紧张素Ⅱ(angiotensinⅡ, AngⅡ)水平明显升高。Ang Ⅱ通过与AT1受体结合,以自分泌／旁分泌的方式作用于心肌成纤维细胞,通过激活丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase, MAPK)及信号转导子与转录激活子3 (signal transducer and activator of transcription3, STAT3)等信号通路促进细胞增殖、迁移并刺激胶原的合成和沉积,最终导致心肌纤维化的形成。胸腺基质淋巴细胞生成素(thymic stromal lymphopoietin,TSLP)是近年来发现的一种新型细胞因子,结构类似于IL-7,最早发现于胸腺基质淋巴细胞,分子量为29KD,主要表达于胸腺基质细胞,上皮细胞,表皮角质细胞,肥大细胞、平滑肌细胞及成纤维细胞等。在外界刺激的作用下,上述细胞合成及分泌TSLP,通过与细胞表面TSLP受体(thymic stromal lymphopoietin receptor, TSLPR)结合而发挥生物学效应。TSLPR为Ⅰ型跨膜蛋白,属于造血细胞因子受体家族。功能型TSLPR以TSLPR和IL-7α受体复合物的形式存在和发挥作用,二者不可或缺。近来有学者发现,TSLP在系统性硬化,瘢痕形成及哮喘病人气道重塑中均具有促进纤维化的作用。同时有研究发现,AngⅡ可促进血管平滑肌细胞表达TSLP且在急性冠脉综合征患者血清中TSLP水平明显升高。既往研究表明在动物体内各器官组织中,心肌组织TSLP表达量最高。然而TSLP是否参与了MI后心肌纤维化的发生及其具体的分子机制,目前尚未见报道。因此,本研究拟在心肌成纤维细胞及小鼠心肌梗死模型中,系统研究TSLP在心肌梗死所致心肌纤维化中的作用及其可能的机制。研究目的1.研究心肌组织中TSLP在小鼠MI后心肌纤维化中的作用及其分子机制；2.研究TSLP对小鼠MI后心功能的影响；3.研究TSLP对血管紧张素Ⅱ诱导的心肌成纤维细胞增殖、迁移及胶原合成能力的影响；研究方法1.慢病毒shRNA-TSLP载体构建：构建3种干扰TSLP表达的慢病毒载体,以携带乱序shRNA的慢病毒载体作为干扰空白对照。分别转染小鼠乳鼠心肌成纤维细胞,选择干扰效率最高的慢病毒为后续实验使用。2. 动物模型的建立及慢病毒体内转染8周龄C57小鼠(20-25g),适应性喂养一周后,在2%异氟烷麻醉下,于胸骨左缘第4肋间开胸,将小鼠心脏挤出胸腔,用7.0号无损伤线结扎冠状动脉左前降支(LAD),结扎线以下小鼠心肌组织变白,室壁活动强度减弱,证明结扎成功。结扎LAD后,将25μL携带1×107UT的TSLP干扰序列慢病毒或对照组慢病毒溶液分别分3点注射到心脏结扎部位周围心肌组织中。术毕,将小鼠心脏还纳回胸腔,挤压掉胸腔中的空气,关胸。术后4周,行心肌组织快速冰冻切片并置于显微镜下观察病毒的转染效率。留取心肌组织并在蛋白水平检测TSLP的表达以确定抑制效果。3. 心脏功能的测定采用心脏二维超声及M超成像技术,通过测定左室收缩／舒张末期直径,左室射血分数及左室短轴缩短率评价小鼠心脏功能。4.组织学染色收集各组小鼠心脏,制备石蜡切片,进行HE,Masson和天狼星红染色分别显示各组小鼠心脏的大体形态结构、梗死面积及心肌内胶原的含量。应用免疫组织化学染色观察心肌组织中TSLP、Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及TGF-β1的表达情况。5. 细胞培养本实验采用新生1-3天的昆明小鼠乳鼠心脏分离和培养原代心肌成纤维细胞。根据实验目的,应用AngⅡ、TSLP重组蛋白及TSLP中和抗体等刺激成纤维细胞,观察其对细胞增值、迁移及胶原合成能力的影响。6. 细胞免疫荧光检测应用细胞免疫荧光法检测细胞中TSLP及其受体TSLPR和IL-7R α的分布及表达。7. 蛋白印迹(Western blot)收集各组组织及细胞,提取蛋白,分别检测TSLP, I型胶原、Ⅲ型胶原、TGF-β1、t-STAT3、p-STAT3、t-ERK、p-ERK、t-JNK、p-JNK、p38及p-p38等蛋白表达水平。8. 酶联免疫吸附法(ELISA)测定各组细胞上清及各组小鼠血清中TSLP水平。9. 细胞增殖和迁移实验采用CCK8及EDU细胞增殖检测试剂盒检测心肌成纤维细胞增殖情况。应用Transwell小室检测心肌成纤维细胞的迁移能力。10.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,结果以均数±标准差(Mean±SD)表示。研究结果1.MI引起心肌组织中TSLP表达增加,且慢病毒转染后抑制效果显著Western blot及免疫组织化学染色结果显示,梗死周围区心肌组织中,TSLP表达增加。与转染对照组慢病毒相比,转染携带干扰TSLP序列的慢病毒组小鼠心肌组织中TSLP表达明显降低。2.抑制TSLP可显著改善MI后心功能异常MI模型建立4周后,心脏超声结果显示左室内径增大,EF及FS较正常小鼠明显降低,提示小鼠心功能减退,而抑制TSLP后心功能明显改善。3.抑制TSLP明显减轻MI诱导的心肌纤维化Masson染色及天狼星红染色均提示MI后心肌组织发生明显的纤维化。Western blot及免疫组织化学染色显示心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TGF-β1蛋白表达水平显著增高,而抑制TSLP后心肌纤维化程度明显减轻。4. TSLP促进心肌成纤维细胞增殖、迁移及胶原合成细胞免疫荧光染色证实心肌成纤维细胞稳定表达TSLP及其受体复合物。应用不同浓度TSLP重组蛋白(5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml)刺激心肌成纤维细胞24h后结果显示,与正常对照组相比,TSLP促进了心肌成纤维细胞Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原和TGF-β1蛋白的表达。EdU及CCK8检测细胞增殖情况发现,与对照组相比,TSLP重组蛋白刺激可明显增强细胞的增殖能力。Tranwell实验结果显示,TSLP重组蛋白刺激促进了细胞迁移。5. AngⅡ促进心肌成纤维细胞表达TSLP,抑制TSLP可减轻AngⅡ诱导的细胞增殖及胶原合成应用不同浓度的AngⅡ刺激细胞,发现AngⅡ剂量依赖性地促进了TSLP的表达和分泌。应用TSLP中和抗体预处理细胞,可明显减轻AngⅡ诱导的胶原的合成及TGF-β1表达增加,同时细胞增殖也受到明显抑制。6. TSLP促进心肌成纤维细胞中STAT3及MAPK(JNK、ERK、p38)信号通路的磷酸化水平TSLP重组蛋白及AngⅡ刺激均可明显增加心肌成纤维细胞内STAT3、MAPK(JNK、ERK、p38)的磷酸化水平。抑制TSLP后上述分子磷酸化水平明显降低,提示STAT3、MAPK(JNK、ERK、38)信号通路的激活参与了TSLP介导的MI后心肌纤维化的发生。研究结论1.心肌梗死后,TSLP表达增加,抑制TSLP可改善心肌纤维化及心功能障碍；2. TSLP可促进心肌成纤维细胞迁移、增殖及合成胶原；3. Ang Ⅱ可促进心肌成纤维细胞合成和分泌TSLP,阻断TSLP可明显减轻AngⅡ对心肌纤维化的影响；4. TSLP介导心肌梗死后心肌纤维化的机制可能与STAT3及MAPK信号通路的激活有关。研究背景心肌梗死(myocardial infarction,MI)后心肌重塑涉及炎症、心肌细胞凋亡、血管新生、成纤维细胞增殖、迁移及细胞外基质的合成和沉积等诸多病理生理过程,最终导致心室形态、结构和功能的改变,严重影响患者的生活质量。心肌细胞凋亡是MI后心肌死亡的主要原因。心肌细胞凋亡程度与MI后心肌重塑及临床症状直接相关。早期炎症反应为心梗后心脏修复所必须,然而过度的炎症反应可进一步诱导心肌细胞凋亡,促进心脏病理性重构。细胞外基质的合成和沉积,在心肌修复早期,可以取代坏死的心肌组织,稳定心脏结构,防止心脏破裂。然而在远期,可促进心肌纤维化的形成,导致心室顺应性降低,心功能下降,最终发展为心力衰竭。心肌重塑是决定心梗患者预后的关键。寻求有效治疗靶点成功调控心肌重塑,是改善心梗患者临床症状,提高生活质量的有效途径。沉默信息转录调控因子1 (silent information regulator of transcription 1,SIRT1)是一种烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD+)依赖的去乙酰化酶,是Sir2样蛋白家族(sirtunits,包括SIRT1-SIRT7)中最主要的成员。SIRT1通过去乙酰化组蛋白及转录因子等靶蛋白,组织特异性地调控氧化应激、细胞增殖、凋亡、炎症及纤维化等诸多病理生理过程。已有研究表明,SIRT1在心血管疾病中发挥着十分重要的作用。SIRT1的激活可通过减轻线粒体氧化应激,改善心肌缺血／再灌注损伤。然而SIRT1在心梗后心肌重塑中的作用及其机制目前尚缺乏系统研究。姜黄素(curcumin, Cur)是从姜科植物中提取的有效植物化学物质。研究表明,姜黄素具有抗炎、抗增殖、抗凋亡及抗氧化应激等作用。姜黄素在心血管疾病中的保护作用已得到证实。已有研究发现,姜黄素可以调节SIRT1的活性。SIRT1活化是否介导了姜黄素心梗后的心肌保护作用目前尚未报道。因此,本研究拟采用结扎小鼠冠状动脉左前降支建立的心梗模型及AngⅡ刺激心肌成纤维细胞及H9C2心肌细胞系统研究姜黄素改善心梗后心肌重塑的作用及其具体机制。研究目的1.建立小鼠心肌梗死模型,明确姜黄素对心梗后心肌重塑的保护作用并初步探讨SIRT1活化在姜黄素心肌保护中作用;2.体外研究中,明确SIRT1在心肌细胞凋亡及心肌纤维化中的作用；研究方法1.动物模型的建立8周龄C57小鼠,适应性喂养1周后,将动物随机分为四组：假手术组(sham)、假手术+姜黄素100 mg/kg (sham+Cur)、心梗模型组(MI)、心梗模型+姜黄素100mg/kg组(MI+Cur)。1周后,在2%异氟烷麻醉下,开胸,将小鼠心脏挤出胸腔,结扎冠状动脉左前降支(LAD),术毕,将小鼠心脏还纳回胸腔,挤压掉胸腔中的空气,关胸。2.心脏功能的测定采用心脏二维超声及M超成像技术,通过测定左室收缩／舒张末期直径,左室射血分数及左室短轴缩短率评价小鼠心脏功能。3.组织学染色收集各组小鼠心脏,制备石蜡切片,进行HE, Masson和天狼猩红染色。HE染色用于评估心脏大体形态及心肌细胞直径的变化。Masson和天狼星红染色用于评价胶原沉积情况及计算心肌梗死面积。应用免疫组织化学染色观察心肌组织中SIRT1、I型胶原、Ⅲ型胶原和TGF-β1蛋白的表达情况。4.心肌细胞凋亡的检测利用TUNEL细胞凋亡检测试剂盒检测各组小鼠心肌组织中细胞凋亡水平。5.细胞培养以H9C2大鼠心肌细胞系及新生1-3天的Wistar乳鼠心脏提取的心肌成纤维细胞为研究对象。AngⅡ刺激细胞体外模拟心梗后状态,以不同浓度的姜黄素预处理细胞,观察姜黄素对心肌细胞凋亡及心肌纤维化的保护作用。设计SIRT1-siRNA,采用脂质体转染H9C2细胞及心肌成纤维细胞沉默SIRT1。同时应用SIRT1抑制剂sirtinol预处理细胞,观察SIRT1活化在姜黄素介导心肌细胞凋亡及心肌纤维化保护中的作用。6.蛋白印迹收集各组组织及细胞提取蛋白,分别检测Bax, Bcl-2, caspase3、TNF-α、 IL-6、Ac-FOX01、SIRT1、 collagen Ⅰ、collagenⅢ、TGF-β1、MMP2、MMP9等蛋白表达水平。7.明胶酶谱采用明胶酶谱法检测心肌成纤维细胞中MMP2及MMP9的活性。8.细胞增殖和迁移实验应用CCK8细胞增殖检测试剂盒检测心肌成纤维细胞增殖情况。利用Transwell小室检测心肌成纤维细胞的迁移。9.统计学分析应用SPSS 18.0软件分析处理数据,并以均数±标准差(Mean±SD)表示。研究结果1.姜黄素减轻了心梗后心肌重塑与假手术组相比,心梗后,心脏形态和结构发生明显变化,表现为心身重量比(HW/BW)增加,左室明显扩张,镜下观察,HE染色显示心肌细胞肥大,排列紊乱,细胞间隙增加；Masson染色及天狼猩红染色结果显示心梗后心肌组织中胶原沉积增加,胶原排列紊乱；免疫组织化学染色显示心梗后小鼠心肌组织中Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及TGF-β1表达增加。Western blot结果显示心肌组织中炎症反应标志物IL-6、TNF-α及细胞凋亡相关蛋白Bax/Bcl-2,caspase3表达增加,与免疫组织化学染色及TUNEL染色结果一致。姜黄素干预治疗显著改善了心梗后心肌重塑。同时Western blot及免疫组织化学染色证实姜黄素增加了心肌组织中SIRT1蛋白的表达。2.姜黄素改善了心梗后左室功能障碍心梗后4周,超声检测小鼠心功能发现,MI组小鼠心功能显著降低,具体表现为左室内径增大,EF及FS较正常小数明显降低,而姜黄素干预治疗显著改善心梗小鼠左室功能障碍。3.姜黄素预处理减少了AngⅡ诱导的H9C2心肌细胞凋亡100 nmol/L AngⅡ刺激H9C2心肌细胞48小时后,Western Blot结果显示凋亡相关蛋白caspase3表达明显升高,Bax/Bcl-2比值显著增加；姜黄素预处理剂量依赖性的减轻了上述变化,同时发现姜黄素促进了细胞中SIRT1表达,并降低下游Ac-FOX01的蛋白表达。4.抑制SIRT1减弱了姜黄素对AngⅡ诱导的H9C2心肌细胞凋亡的保护作用分别采用SIRT1-siRNA基因沉默及SIRT1抑制剂(sirtinol)处理细胞,与单纯AngⅡ刺激组相比,抑制SIRT1显著增加了凋亡相关蛋白的表达。证实SIRT1在AngⅡ诱导的心肌细胞凋亡中具有保护作用同时发现抑制SIRT1后姜黄素对心肌细胞凋亡的保护作用明显减弱。5.姜黄素预处理改善了AngⅡ刺激诱导的心肌成纤维细胞纤维化分别采用1、10、100 nmol/L的AngⅡ刺激心肌成纤维细胞12、24及48h,观察对心肌成纤维细胞胶原合成的影响。Western blot结果显示AngⅡ对胶原合成的影响成剂量和时间依赖性。选择100 nmol/L AngⅡ刺激24h作为后续实验的条件。姜黄素预处理剂量依赖性地降低了胶原的合成及细胞外基质的降解。Western blot结果显示：Ⅰ型胶原、Ⅲ型胶原及TGF-β1的表达降低；MMP2、 MMP9的表达及活性显著降低；CCK8实验及Transwell实验结果显示,姜黄素显著抑制了AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞的增殖及迁移。6.抑制SIRT1减弱了姜黄素抗心肌纤维化的作用采用SIRT1-siRNA基因沉默法抑制SIRT1表达后,发现胶原合成及细胞外基质的降解明显增加并且促进了心肌成纤维细胞增殖及迁移。姜黄素的抗心肌纤维化作用明显减弱。研究结论1.MI后,姜黄素通过活化SIRT1改善心肌重塑及心功能异常；2.姜黄素通过活化SIRT1减轻AngⅡ诱导的H9C2心肌细胞凋亡；3.姜黄素通过活化SIRT1抑制AngⅡ诱导的心肌成纤维细胞增殖、迁移及胶原合成。