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隐孢子虫(Cryptosporidium spp.)和弓形虫(Toxoplasma gondii)是两种不同种属的寄生性原虫。它们能够感染几乎所有的温血动物,并广泛分布于世界各地,对人类健康和畜牧业的发展构成严重威胁。奶牛感染隐孢子虫后,其大量的卵囊由奶牛的粪便散布到环境中。随着奶牛畜牧业的发展,奶牛粪便成为隐孢子虫的重要传染源。猫科动物感染弓形虫后,大量的弓形虫卵囊可随猫的粪便散播到环境中,孢子化的卵囊具有极强的感染能力,并且对外界环境有较强的抵抗力。因此建立高效、快速检测奶牛粪便中隐孢子虫卵囊和环境中弓形虫卵囊的方法,对控制隐孢子虫病和弓形虫病的传播显得尤为重要。重组酶聚合酶扩增(Recombinase polymerase amplification,RPA)是近几年出现的有望替代PCR的一种新的核酸扩增技术。反应过程中不需要模板链的热变性,可以在恒定的低温条件下快速扩增DNA或者RNA。其具有特异性强、灵敏度高、快速、操作简便、适用于现场快速诊断等特点,在动物病原的快速检测方面具有巨大的前景和市场。结合相应的探针,RPA扩展产物可以在侧流层析试纸条(lateral flow strip)上显色,从而形成的侧流层析-重组酶聚合酶扩增技术(LF-RPA)比PCR更加适合于现场检测。本研究应用LF-RPA技术,建立了快速检测奶牛粪便中隐孢子虫和环境中弓形虫的方法。研究结果如下:1.隐孢子虫卵囊的DNA可在月桂酰肌氨酸钠(LSS)浓度为0.1%的热水中释放。释放的隐孢子虫DNA用LF-RPA方法进行检测,在30-45℃的条件下,30分钟内最低可检测到0.5个隐孢子虫卵囊的DNA,敏感性高于传统的PCR检测方法,并且与弓形虫、蓝氏贾第虫、柱状艾美尔球虫和微孢子虫无交叉反应。对12份奶牛粪便进行检测,巢式PCR检测出4份为隐孢子虫阳性,而LF-RPA检测出6份为隐孢子虫阳性。2.由于弓形虫卵囊壁结构的坚固性,本研究将环境样品用液氮冷冻并进行反复研磨以得到弓形虫卵囊的DNA。基于弓形虫B1基因设计的引物和探针,结合该DNA提取方法建立了检测环境中弓形虫卵囊的LF-RPA检测方法,以高于巢式PCR检测方法10倍的敏感性,可检测出0.1个弓形虫卵囊的DNA。该方法特异性强。对35份环境样品进行检测,巢式PCR和LF-RPA均检测出5份阳性样品。