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大量研究证实,绿肥是保持和提高土壤肥力和质量的有效措施之一,虽然已有绿肥对土壤微生物影响的相关研究报道,但由于所用方法和技术所限,相关研究既不系统也不深入,特别是绿肥对水稻根内生细菌影响研究尚属空白。本课题以湖南祁阳农田系统国家野外科学观测研究站具有28年(1982-2010)长期定位历史的稻-稻-紫云英豆科绿肥及稻-稻-冬闲轮作水稻根为材料,采用基于16S rDNA为基础的先进分子生态学方法与传统培养方法相结合,深入系统研究紫云英绿肥轮作水稻根内生微生物多样性。本研究同时将针对性地分离培养微生物类群,对可培养微生物溶磷性,产植物生长素(IAA),产铁载体,拮抗及固氮酶活性等促生功能研究。通过培养方法检测水稻根内生微生物数量,结果表明：稻-稻-紫云英绿肥轮作系统水稻根中微生物平均数量为7.75×106cfu·g-1鲜土,比稻-稻-冬闲高78.17%。通过传统细菌分离培养方法从稻-稻-冬闲和稻-稻-紫云英水稻根中分别分离77株和169株细菌。对246株细菌溶磷、分泌生长素(IAA)及分泌铁载体的功能进行了初步测定,结果表明稻-稻-紫云英内生细菌具有溶解无机磷活性、溶解有机磷活性、分泌生长素(IAA)能力及产铁载体能力菌株分别为139、12、72、73株,稻-稻-冬闲分别为67、8、40、57株。其中菌株ZYY43的溶磷活性最高；菌株ZYY170产IAA能力最高,为419.17ug/mL;菌株DX78分泌铁载体能力最强,达到了“++++”的水平。在上述研究基础上选取48株菌进行拮抗试验,结果显示,3株菌对棉花红腐病菌(Fusarium moniliforme ACCC36127)有抑制作用,其中的2株对水稻白叶枯病菌(Xanthomonas campestris pv.oryzae ACCC05509)有抑制作用。固氮酶活性检测结果发现,菌株DX35的固氮酶活性最高为181.21nmolC2H4/mg protein hr,为参比菌株圆褐固氮菌(Azotobacter chroococcum ACCC10006)的10倍左右,在固氮菌肥开发方面具有非常大的应用潜力。并在此基础上利用大试管和盆栽水稻促生试验的方法筛选10株兼具多种促生功能的优良菌株,菌株ZYY5、ZYY10和ZYY136准备进行田间试验。采用传统的分离培养方法结合分子生物学技术对稻-稻-紫云英和稻-稻-冬闲水稻根内生可培养细菌群落多样性进行研究。用限制性内切酶HaeⅢ和RsaⅠ联合酶切,获得246株菌酶切指纹图谱。结果表明,HaeⅢ和RsaⅠ联合酶切产生了23个基因分型,单一酶切产生的基因分型少。16S rDNA系统发育分析结果表明,分离得到的77株稻-稻冬闲细菌分属14属15个种,分离得到的169株稻-稻紫云英细菌分属19属21个种。两个样品中细菌群落大多数为变形菌纲(Proteobacteria)。其中β-变形菌纲(β-proteobacteria)占据优势地位,其次为γ-变形菌纲(γ-proteobacteria),其他分属α-变形菌纲(α-proteobacteria)及厚壁菌门(Firmicutes)。放线菌门(Actinobacteria)只存在于稻-稻-紫云英水稻根内生可培养细菌中。其中Herbaspirillum和Cedecea为两个处理中分离到的共有优势种群,而稻-稻-紫云英水稻根内生细菌中的伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)、假单胞菌属(Pseudomonas)、鞘氨醇单胞菌属(Sphingomonas)和泛菌属(Pantoea)也为分离到的优势种群,且在稻-稻-紫云英水稻根这一特殊的生存空间中有1株潜在的根瘤菌属(Rhizobium)新种存在。可培养的细菌中,编号为ZYY136菌株其16S rDNA基因序列在NCBI Blast中比对发现与根瘤菌属(Rhizobium)的Rhizobium alkalisoli (CCBAU01393)的同源性最高,为96.174%。以近缘菌株CCBAU01393(Rhizobium alkalisoli)和SO2(Rhizobium huautlense)为参比菌株,采用多相分类方法,对其形态学特征、唯一碳氮源利用、脂肪酸组成成分分析(MIDI)、 ERIC-PCR和BOX-PCR指纹图谱分析、16S rDNA全序列分析及atpD、gltA、gyrB、recA、 rpoB、thrC持家基因序列的系统发育进行分析。实验结果初步证实,ZYY136菌株为根瘤菌属(Rhizobium)的一个新种。利用细菌通用引物,对从2个水稻根样品中提取总DNA进行16S rDNA基因的PCR扩增,构建克隆文库对PCR产物进行分析,结果显示,2个水稻根样品中细菌群落大多数为变形菌纲(Proteobacteria)。其中β-变形菌纲(β-proteobacteria)占据优势地位,其次为α-变形菌纲(α-proteobacteria)和δ-变形菌纲(δ-proteobacteria),其他分属及厚壁菌门(Firmicutes)、拟杆菌门(Bacteroidetes)和放线菌门(Acidobacteria)等,但在所占比例上有较大区别。且(Armatimonadetes)在稻-稻-冬闲模式(DX)水稻根中存在,而稻-稻-紫云英豆科绿肥还田(ZYY)处理中没有被发现。其中伯克霍尔德氏菌(Burkholderia)和根瘤菌(Bradyrhizobium)为两个处理中分离到的共有优势种群,而其数量在稻-稻-紫云英水稻根内分布较高。纯培养方法从稻-稻-冬闲和稻-稻-紫云英水稻根样品中得到的细菌群落与克隆文库构建检测到的群落多样性相比,均发现2个水稻根样品中细菌群落大多数为变形菌纲(Proteobacteria)。利用可培养和非培养方法对分离的根内生细菌的物种多样性分析均表明：长期稻-稻-紫云英豆科绿肥轮作水稻根内生细菌物种丰富度指数、多样性指数、均匀度指数、优势度指数的值均较稻-稻-冬闲水稻根内生细菌高,证明豆科绿肥还田内生细菌多样性较为丰富,且首次在稻-稻-紫云英豆科绿肥轮作水稻根中发现古菌存在。