超声改性裂褶多糖制备及免疫调节活性研究

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裂褶多糖(SPG)是裂褶菌子实体、菌丝体或发酵液中提取出来的水溶性胞外多糖,具有增强免疫力和抗肿瘤的功效。但天然SPG分子量大(>106 Da),粘度较大,制约其应用。本文采用超声工艺对固体发酵SPG进行降解处理,得到不同分子量的超声裂褶多糖(USPG)级分;对这些USPG级分的初级结构和流变性质开展研究,并通过体外和体内动物实验的方法研究其免疫及抗肿瘤活性。主要研究内容和结果如下:考察超声处理对制备不同分子量裂褶多糖的影响,结果表明,随超声时间和强度增强SPG的分子量逐渐降低,降解动力学符合降解二级动力学模型。最终选定降解超声参数:时间10 min,超声强度796 W/cm2。同时结合乙醇分级沉淀和透析,最终得到3个USPG级分,USPG40、USPG60、USPG80,分子量分别集中在106-107 Da、105-106 Da、104-105 Da,样品纯度分别为93.15%、90.56%、88.77%,单糖组成主要为葡萄糖,样品均一性较好。通过红外光谱和甲基化分析进行研究,结果表明超声处理并未改变糖链类型和链接方式。流变特性分析结果表明,SPG为假塑性流体,浓度升高到10 mg/ml时表现为固体特性(储能模量G’>损耗模量G’’)。超声处理后USPG40表现假塑性流体行为,而USPG60、USPG80表现出牛顿流体行为。对比同浓度下(5 mg/ml)裂褶多糖溶液,经过超声处理的USPG40在角频率为1.1 s-1时表现出黏性行为(储能模量G’<损耗模量G’’),USPG60在较低角频率0.05 s-1以后,表现出黏性行为,USPG80则完全表现出黏性行为。通过体外实验的方法对SPG及USPG级分的免疫及抗肿瘤功效进行研究。结果表明SPG组和USPG各级分(25-600μg/ml)对促进脾淋巴细胞增殖、巨噬细胞RAW264.7的NO释放和抑制乳腺癌细胞T-47D活性具有良好的功效。相比SPG,USPG级分具有更高的活性,USPG60的脾淋巴细胞增殖、巨噬细胞RAW264.7的NO释放和抑制乳腺癌细胞T-47D活性最佳。采用体内模型进一步评价SPG和USPG级分的免疫及抗肿瘤功能。SPG和USPG级分的含多糖血清均可增强正常大鼠免疫功能,其中浓度20%的USPG60含多糖血清组对脾淋巴细胞增殖的促进作用最强,血清中免疫因子IL-2(169.85 pg/ml)和TNF-α(85.62 pg/ml)含量最高。S180荷瘤小鼠的研究实验表明,SPG和USPG级分均可显著增强荷瘤小鼠迟发型变态反应(DTH)、促进LPS诱导的B淋巴细胞增殖和提高NK细胞活性,USPG60综合表现最佳,其抑瘤率达到37.75%。此外,肿瘤切片的组织学观察发现,USPG60组和USPG80组在小鼠体内均可引起肿瘤细胞凋亡,大量炎性细胞浸润肿瘤。
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