研究背景与目的脑血管疾病严重危害人类健康,是世界范围内致死、致残的主要疾病之一。脑血管病以缺血性为多见,约占80%,因其发病机制复杂,部位特殊,目前缺乏有效的治疗药物。葛根素(puerarin, PUE)属于黄酮类化合物,对心脑血管疾病具有明确的疗效,因其口服生物利用度很低(仅有5%-6%),虽然可部分透过血脑屏障,但在脑中浓度极低,故临床应用受到很大限制。乙酰葛根素(acetylpuerarin, AP)为葛根素乙酰化衍生物,我们前期的研究结果证明,乙酰葛根素具有脑保护作用,能够显著减少脑缺血再灌注损伤大鼠的脑梗死体积,改善神经功能缺陷,在缺血性脑病的治疗方面显示出良好的应用前景。但乙酰葛根素在脑组织中的分布如何?体内是通过何种形式起作用的?目前未见文献报道。纳米粒(nanoparticle,NP)是目前常用的脑部给药制剂。其制备过程简单、药物释放稳定,可避免药物被降解或被P-糖蛋白(P-glycoprotein, P-gp)泵出细胞,具有缓释效果、药物保护作用、提高药物疗效、降低药物毒性等优点,是脑靶向制剂的良好载体。作为制备纳米粒常用的载体,聚乳酸-羟基乙酸(PLGA),因其可生物降解为乳酸和羟基乙酸、最终代谢为水和二氧化碳,对人体无毒、无蓄积性,而被FDA批准用于临床研究。本实验的研究目的之一,即在前期研究的基础上,以PLGA为载体、制备乙酰葛根素纳米给药系统,观察乙酰葛根素的体内过程及其在脑组织中的分布,进一步研究乙酰葛根素PLGA纳米粒的脑靶向性及其对脑缺血再灌注损伤的保护作用。炎症反应是缺血性脑损伤的重要机制之一,缺血和再灌注早期产生的细胞因子(如IL-1β、TNF-α等)和黏附分子(如ICAM-1、VCAM-1等)构成了缺血性损伤向炎症性损伤转变的基础。因此,及时有效的抗炎治疗有助于缓解脑缺血再灌注造成的损伤程度。高迁移率族蛋白1(high mobility group box1, HMGB1)是一类广泛存在于真核细胞胞核内、高度保守的非组蛋白染色体结合蛋白。近年来大量研究证实,HMGB1可作为致炎细胞因子参与炎症反应。炎症状态下HMGB1可由坏死细胞被动释放或由受刺激的单核/巨噬细胞等主动分泌至胞外,与高级糖化终末产物受体(eceptor for advanced glycation end-products,RAGE)和Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)结合,最终激活NF-κB,介导炎症反应。HMGB1及其受体在中枢神经系统广泛表达,在炎症、凋亡及血-脑屏障通透性调节中起着重要作用。在脑缺血损伤时,由于脑血管闭塞,脑血流量迅速下降,导致缺血核心区出现急性坏死,而周围组织(即缺血半暗带)也经历了炎症、自由基、兴奋性氨基酸毒性、细胞内Ca2+超载、能量代谢障碍、细胞凋亡等病理生理学过程,促使神经细胞、神经胶质细胞及脑血管内皮细胞释放HMGB1,而HMGB1又能加剧谷氨酸和糖氧剥夺的神经损害作用,促使iNOs、COX-2、IL-1β和TNF-α等炎症介质释放,促进神经细胞死亡。可见,HMGB1是联系脑缺血后早期兴奋性毒性损伤和随后炎症损伤的中介。前文提到,HMGB1与RAGE或TLRs结合后可激活NF-κB、介导炎症反应。我们前期研究结果表明,乙酰葛根素具有抗炎作用,能降低或下调脑缺血再灌注损伤引起TNF-α、IL-1β、ICAM-1及VCAM-1等细胞因子及黏附分子的升高,也可降低脂多糖刺激所致星形胶质细胞NF-KB(p65)在胞核内表达的升高,从而发挥其抗炎作用。那么,乙酰葛根素对HMGB1-TLR4-NF-KB信号通路的上游因子HMGB1有何作用?其对该信号通路的调控机制如何?未见文献报道。本实验的另一个研究目的,即是在前期研究的基础上,深入探讨乙酰葛根素对HMGB1蛋白表达及释放的影响及其基于HMGB1-TLR4-NF-KB信号通路的抗炎机制。实验方法一、乙酰葛根素-PLGA纳米粒的制备及质量评价(一)以PLGA为载体材料,采用溶剂扩散法制备吐温-80包衣的乙酰葛根素-PLGA纳米粒(AP-PLGA-NPs)。(二)在单因素考察的基础上,以PLGA浓度、相体积比及AP投药量为主要考察因素、以AP在纳米粒中的包封率、载药量为评价指标,采用均匀设计-效应面结合法优化处方与制备工艺。(三)对优化条件下制备的AP-PLGA-NPs通过形态观察、粒径及Zeta电位测定、体外释药实验、初步稳定性考察等对纳米粒进行质量评价。二、乙酰葛根素-PLGA纳米粒大鼠体内的药代动力学研究(一)通过对样品处理方法、色谱条件、质谱条件、方法专属性、标准曲线、精密度、回收率、基质效应等进行考察,建立AP及其代谢物PUE血浆浓度测定的液相色谱-质谱/质谱(LC-MS/MS)分析方法,并进行方法确证。(二)采用LC-MS/MS法测定AP静脉及口服给药后AP及代谢物PUE在大鼠体内的血浆浓度。(三)采用DAS2.1.1软件计算AP及PUE药代动力学参数,考察AP的体内过程,评价纳米粒对AP及PUE药代动力学参数的影响。三、乙酰葛根素-PLGA纳米粒在小鼠体内的组织分布及脑靶向性评价(一)通过对样品处理方法、色谱条件、方法专属性、标准曲线、精密度、回收率等进行考察,建立AP及其代谢物PUE组织浓度测定的高效液相色谱(HPLC)分析方法,并进行方法确证。(二)采用HPLC法测定AP静脉给药后PUE在小鼠不同组织的经时药物浓度、AP及PUE在脑组织的经时药物浓度,考察其组织分布。(三)以总靶向系数(overall targeting efficicency, Te)、相对摄取率(relative targeting efficicency, Re)和峰浓度比(Ce)为靶向评价指标,评价AP-PLGA-NPs的脑靶向性。四、乙酰葛根素-PLGA纳米粒对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用(一)参照Zea Longa大脑中动脉内栓线法制备大鼠脑缺血再灌注损伤模型。(二)实验分为假手术(sham)组、脑缺血再灌注模型(I/R)组、AP溶液低剂量组(AP-L)、AP溶液高剂量组(AP-H)、AP-PLGA纳米粒(AP-NPs)组及对照药丙酮酸乙酯(EP)组。采用Zea Longa评分法进行神经功能缺陷评分、TTC染色法测定大鼠脑梗死体积、HE染色法观察大鼠缺血皮层及海马组织病理形态学变化、TUNEL染色法观察缺血皮层神经细胞凋亡率。以上述指标为主要评价指标,考察／AP-PLGA-NPs对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。五、乙酰葛根素对HMGB1蛋白表达的影响及其基于HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路的抗炎机制(一)建立BV-2细胞缺糖缺氧损伤模型,分为正常对照组、OGD模型组、不同剂量(0.1、0.4、1.6μM)乙酰葛根素处理组.丙酮酸乙酯(1mM)处理组.采用CCK-8试剂盒检测OGD6h、12h、24h、48h各组BV-2细胞活性,考察乙酰葛根素对OGD损伤细胞活性的影响；采用细胞核Hoechst33258染色法、FITC-Annexin V/7-AAD双染法检测BV-2细胞凋亡情况,考察乙酰葛根素对OGD损伤细胞凋亡的影响；采用免疫荧光法观察乙酰葛根素对细胞内HMGB1释放的影响。(二)观察大鼠脑缺血再灌注损伤后不同时间点HMGB1的动态表达Western blot法检测I/R后不同时间点HMGB1的表达；酶联免疫分析(ELISA)法测定I/R后不同时间点大鼠血清中HMGB1浓度。(三)考察AP对HMGB1.TLR4.NF-κB(P65)蛋白表达的影响实验分为假手术(sham)组、脑缺血再灌注模型(I/R)组、乙酰葛根素低剂量组(AP-L,15mg/kg).乙酰葛根素高剂量组(AP-H,30mg/kg).丙酮酸乙酯组(EP,40mg/kg).采用、Vestern blot法检测I/R24h HMGB1、TLR4、NF-κB(P65)的蛋白表达；免疫组化法分析HMGB1、NF-κB(P65)阳性细胞表达及在胞核或胞浆的转位；ELISA法测定大鼠血清中HMGB1浓度,进一步考察AP的干预效果,探讨其基于HMGB1-TLR4-NF-κB信号通路的抗炎机制。实验结果一、乙酰葛根素-PLGA纳米粒的制备及质量评价(一)根据均匀设计-效应面优化法确定的最佳处方PLGA在丙酮中的浓度=18mg/mL,相体积比=4,投药量=7mg。(二)依据优化处方制备的PLGA纳米粒外观为蓝色带乳光胶体溶液,电镜下观察纳米粒子呈圆形,无粘连,平均粒径145.0nm, Zeta电位-14.81mV,多分散系数PI为0.153,EE为90.51%,DL为17.07%。(三)AP纳米粒体外释药符合双相动力学过程,分为突释相和缓释相。经经典释放模型拟合,AP原料药体外释放符合一级动力学方程,纳米粒体外释放符合Higuchi方程。AP-PLGA-NPs具有明显的缓释效果。(四)稳定性考察表明AP纳米胶体溶液4℃保存较为稳定。二、乙酰葛根素-PLGA纳米粒大鼠体内的药代动力学研究(一)AP静脉给药后,大鼠血浆中可同时测得AP及其代谢物PUE；而AP口服给药后,血浆中仅测得代谢物PUE。(二)与AP溶液相比,AP-PLGA-NPs的药代动力学参数显著改变,AP及代谢物PUE的AUC0-∞为5398.60±724.77、15106.98±3652.73ng-mL-1·h,分别为AP溶液的2.90及2.29倍；AP及PUE的t1/2为3.22±0.52h、3.58±0.41h,分别为AP溶液的2.19及1.98倍；但AP及PUE的Cmax与AP溶液相比无显著性差异。(三)大鼠口服AP-PLGA-NPs后,PUE的AUC0-∞、Cmax为6175.66±350.31ng·mL-1·h、1301.13±101.41ng·m mL-1,分别为与AP混悬液的2.75及1.78倍,表明PLGA纳米粒可促进AP的吸收、提高生物利用度。三、乙酰葛根素-PLGA纳米粒在小鼠体内的组织分布及脑靶向性评价(一)小鼠静脉注射AP溶液后,PUE在肝脏分布最多、其次为肾脏,然后依次为心、肺、脾、脑；静脉注射AP-PLGA-NPs后,PUE的组织分布显著改变,各组织中AUC值均有所增加,以脑及肝脏组织增加最为显著；PUE在各组织的滞留时间明显延长,以脑组织最为显著。(二)小鼠静脉注射AP制剂后,脑组织中可同时测得AP及其代谢物PUE。(三)与AP溶液相比,AP-PLGA-NPs静脉给药后,AP及PUE在脑组织的分布显著升高,表现为PUE的Te值由1.28%增至2.29%,AP及PUE的Re值分别为2.40、2.58,Ce值分别为1.91、1.89,表明纳米粒能显著增加药物脑内分布。四、乙酰葛根素-PLGA纳米粒对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用(一)I/R模型组大鼠神经功能缺陷评分(NDS)多为3分。AP静脉给药可显著降低大鼠NDS(p<0.01)。与同剂量AP溶液(AP-L,2.17±0.39)相比,纳米制剂组(AP-NPs,1.42±0.51)降低大鼠NDS的效果更为显著(p<0.01)。(二)TTC染色结果显示I/R模型组大鼠缺血侧脑梗死体积达40.14±2.61%。AP静脉给药可显著降低脑梗死体积(P<0.01)；与同剂量AP溶液(AP-L,29.39±3.67%)相比,纳米制剂组(AP-NPs,20.47±2.26%)降低脑梗死体积的效果更为显著(P<0.01)。(三)HE染色结果显示I/R模型组大鼠缺血侧海马组织细胞水肿明显,层次不清,细胞排列疏松紊乱,皮层组织同样损伤明显；海马及皮层组织胞核固缩现象明显,部分神经元坏死。而AP给药后脑损伤明显减轻,其中以纳米制剂(AP-NPs)组干预效果最为显著。(四)TUNEL染色结果显示假手术组大鼠缺血侧皮层阳性细胞很少,而IR组缺血侧皮层阳性细胞数目显著增多(P<0.01)。AP给药后可显著减少缺血侧皮层阳性细胞数目,与同剂量AP溶液相比,纳米制剂(AP-NPs)组抑制神经细胞凋亡的效果更为明显(p<0.05)。五、乙酰葛根素对HMGB1蛋白表达的影响及其基于HMGB1-TRL4-NF-KB信号通路的抗炎机制(一)CCK-8检测结果表明AP可显著提高OGD损伤BV-2细胞的存活率；Hoechst33258染色、FITC-Annexin V/7-AAD双染结果表明AP可抑制BV-2细胞的凋亡；免疫荧光结果表明AP可抑制HMGB1自胞核至胞浆的释放,为其对细胞保护作用的机制之一。(二)大鼠脑缺血再灌注后不同时间点HMGB1的动态表达1. Western blot检测结果显示假手术组大鼠缺血侧皮层组织有极少量HMGB1胞浆表达,I/R12h后可见HMGB1胞浆表达明显升高,至24h达峰值,48h逐渐下降,至72h仍明显高于假手术组。2.ELISA测定结果表明,I/R12h后HMGB1血清浓度较假手术组有所升高,但无统计学意义；I/R24h HMGB1血清浓度达峰值,I/R72h后HMGB1血清浓度仍明显高于假手术组(P<0.05)。HMGB1血清浓度测定结果与Western blot结果相符。(三)AP对HMGB1、TLR4、NF-κB(P65)蛋白表达的影响1.与I/R组相比,AP静脉给药可显著降低HMGB1、TLR4、NF-κB(P65)的蛋白表达(P<0.01),且AP高剂量作用效果更明显。2.与I/R组相比,AP静脉给药可显著降低HMGB1血清浓度(P<0.01),但AP低剂量及高剂量的作用效果与EP相比无显著性差异(P>0.05)。3.免疫组化结果显示假手术组仅少量HMGB1表达于胞核、少量NF-kB(P65)表达于胞浆；I/R模型组可见HMGB1、NF-κB(P65)大量表达于胞核、胞浆；AP可抑制HMGB1、NF-κB(P65)日性细胞的表达,且可抑制HMGB1从胞核至胞浆、NF-κB(P65)亚基自胞浆至胞核的转位。结论一、以PLGA为载体材料、采用溶剂扩散法制备吐温-80包衣的乙酰葛根素纳米粒,粒径分布均匀,体外释放具有缓释效应。二、乙酰葛根素在体内代谢为葛根素；静脉给药后,体内可同时测得乙酰葛根素及其代谢物葛根素。PLGA纳米粒可显著改变乙酰葛根素及葛根素的药代动力学行为、提高其在脑组织中的分布,呈现脑靶向特征。三、乙酰葛根素体外对缺糖缺氧损伤的BV-2细胞具有保护作用,静脉给药后对大鼠脑缺血再灌注损伤具有保护作用；载药纳米粒对脑缺血再灌注损伤的保护作用优于原料药,与其所具有的缓释及脑靶向性有关；该保护效应是乙酰葛根素及其代谢物葛根素共同作用的结果。四、大鼠口服给药后,血浆中仅测得代谢物葛根素。PLGA纳米粒可显著提高乙酰葛根素的口服生物利用度。五、乙酰葛根素可抑制HMGB1、TLR4、NF-κB(P65)的蛋白表达,抑制HMGB1的核释放及NF-κB P65亚基自胞浆至胞核的转位,为其抗炎机制之一。