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研究目的:通过检测慢病毒介导的γ-谷氨酰基羧化酶(Vitamin K dependent gammaglutamyl carboxylase,GGCX)基因转染兔骨关节炎软骨细胞后对其凋亡的影响,以及对兔膝骨性关节炎的软骨细胞中MMP13、Ⅱ型胶原和Ⅹ型胶原的影响,探讨其对兔膝关节骨性关节炎软骨细胞的作用。进而为体外骨性关节炎的基因治疗提供实验依据。研究方法:1、选取12只重量约(2.0±0.2)kg左右的日本雄性大耳兔,运用膝前交叉韧带切断的方法构建动物模型。对白兔进行6周饲养后处死,对兔膝关节的软骨细胞进行分离以及培养,最后运用Alcian Blue染色法以及Ⅱ型胶原纤维染色法对软骨细胞做鉴定。2、随机将软骨细胞分为三个组:空白对照组(不作任何处理)、阴性对照组(转染不含GGCX慢病毒的空载体)、转染组(转染含GGCX慢病毒)。检测转染成功后分别用q RT-PCR法及Western blot法检测各组中软骨细胞中GGCX、MMP13、Ⅱ型胶原、Ⅹ型胶原m RNA及蛋白表达水平。3、运用Annexin V-FITC&PI法来检测各个分组中软骨细胞的凋亡的情况。4、运用茜素红染色软骨细胞进行组织学检查。研究结果:1、兔骨关节炎的软骨细胞在初代中显现为扁平,多角不规则,有几个隆突,胞核为椭圆形,位于胞体中间。Alcian Blue染色软骨细胞表现天蓝色,Ⅱ型胶原纤维染色发现软骨细胞和胞外基质表现棕色或黄色。2、q RT-PCR检测结果示:GGCX在转染组中表达水平明显升高,MMP13在转染组中的表达水平明显降低,Ⅱ型胶原在转染组中表达明显升高,X型胶原在转染组中表达水平亦明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),阴性对照组以及空白对照组之间相比较未见显著差异(P>0.05);W-B检测结果显示:GGCX在转染组中表达水平明显升高,MMP13在转染组中的表达水平明显降低,Ⅱ型胶原在转染组中表达水平明显升高,X型胶原在转染组中表达水平亦明显降低,差异有统计学意义(P<0.05),阴性对照组以及空白对照组之间相比较未见明显的差异(P>0.05)。3、运用Annexin V-FITC&PI法检测各个分组凋亡率的结果显示:转染组总凋亡率为(17.833±2.612)%,与空白对照组总凋亡率(25.467±2.623)%以及阴性对照组总凋亡率(26.167±2.637)%相比明显降低,差异具有统计学意义(P<0.05),阴性对照组以及空白对照组相比较未见明显差异存在(P>0.05)。4、茜素红染色结果显示:转染组中软骨基质深染,细胞数量多,可见少量钙结节,空白组和阴性对照组中软骨基质染色均一,大量钙结节形成。结论:1、采取前叉韧带切断大白兔的韧带能够成功造出白兔骨关节炎的模型,并能够成功分离培养出兔膝骨性关节炎的软骨细胞;2、慢病毒能成功介导GGCX基因转染兔骨性关节炎软骨细胞使其表达显著增加;3、转染含GGCX慢病毒能够使软骨细胞Ⅱ型胶原的表达显著增加;4、转染含GGCX慢病毒能够使软骨细胞MMP13、X型胶原的表达显著降低;5、转染含GGCX慢病毒后能够使骨性关节炎中软骨细胞的凋亡受到显著抑制;6、转染含GGCX慢病毒后能够使骨性关节炎钙结节形成受到显著抑制。