苯胺及其衍生物是一类重要的化工中间体，大量应用于工业染料、除草剂、橡胶和磺胺类药物等的合成。然而，苯胺类物质具有致癌、致畸、致突变作用，环境中残留的苯胺类物质已对人类健康构成了威胁。目前，微生物是去除环境中苯胺残留的主力军，它们首先利用苯胺双加氧酶(AD)将苯胺类化合物转化为相应的邻苯二酚，然后再经邻位或间位开环途径进入三羧酸循环。AD由四个组分组成:谷氨酰胺合成酶，谷氨酰胺氨基转移酶，氧化酶和还原酶。其中，谷氨酰胺合成酶被证明负责将苯胺转化为γ-谷氨酰苯胺(γ-GA)。谷氨酰胺氨基转移酶被推测可将γ-GA重新转化成苯胺，使得细胞内γ-GA的含量维持在一个合适范围。氧化还原酶被推测将γ-GA进一步转化为邻苯二酚。然而，首先，AD的工作机制还不清楚;其次，谷氨酰胺氨基转移酶组分是否参与将γ-GA进一步转化为邻苯二酚仍是未知的;再者，不同的AD具有不同的底物特异性，而这种底物特异性由哪些组分决定也是未知的。这些问题限制了对现有苯胺双加氧酶进行有效的改造以扩大其底物谱，转化更多难降解的苯胺衍生物。
　　本研究以苯胺双加氧酶AtdA和AdoQTA1A2B为研究材料来阐述上述三个问题，atdA(包含基因atdA1，atdA2，atdA3A4，atdA5)和ado(包含基因adoQ，adoT，adoA1A2，adoB)是两个已报道的苯胺双加氧酶基因簇，分别来自菌株Acinetobacter sp.YAA和Sphingobium sp.YBL2。其中，atdA1和adoQ为编码谷氨酰胺合成酶的基因，atdA2和adoT为编码谷氨酰胺氨基转移酶的基因，atdA3A4和adoA1A2为编码氧化酶的基因，atdA5和adoB为编码还原酶的基因。atdA编码的产物AtdA和ado编码的产物AdoQTA1A2B具有不同的底物特异性，AtdA可以催化邻甲基苯胺而AdoQTA1A2B可转化对甲基苯胺。具体研究工作主要分为以下几点:
　　1.苯胺双加氧酶AtdA和AdoQTA1A2B中各个组分的表达与纯化
　　本研究通过在谷氨酰胺合成酶(AtdA1、AdoQ)和谷氨酰胺氨基转移酶(AtdA2、AdoT)的N末端分别融合一个StrepⅡ标签，在氧化酶(AtdA3A4、AdoA1A2)和还原酶(AtdA5、AdoB)的N末端分别融合一个His标签，于大肠杆菌中首次重组表达和纯化了苯胺双加氧酶AtdA和AdoQTA1A2B的每一个组分。
　　2.体外重构苯胺双加氧酶
　　以苯胺或其中间产物γ-GA为底物，成功检测到纯化的各个组分的活性。在去除谷氨酰胺氨基转移酶组分条件下，成功地在体外重构了有活性的苯胺双加氧酶，并能转化大约80％的苯胺生成邻苯二酚。与此同时，本研究也发现谷氨酰胺氨基转移酶组分在体外条件下是非必需的。
　　3.谷氨酰胺合成酶组分影响苯胺双加氧酶的底物特异性
　　以苯胺及其衍生物和γ-GA及其衍生物为底物，分别研究苯胺双加氧酶中各个组分的底物特异性。在本研究的实验条件，谷氨酰胺氨基转移酶组分和还原酶组分均没有底物特异性，谷氨酰胺合成酶组分和氧化酶组分具有各自的底物特异性。进一步分析发现，在催化对甲基苯胺、邻甲基苯胺过程中，氧化酶组分并没有底物选择性，谷氨酰胺合成酶的底物特异性在苯胺双加氧酶催化这两种物质中发挥关键作用。
　　4.氧化酶组分影响苯胺双加氧酶的底物特异性
　　在研究苯胺双加氧酶中各个组分的底物特异性时，本研究也发现在催化2-异丙基苯胺过程中，谷氨酰胺合成酶组分可以催化2-异丙基苯胺生成γ-谷氨酰-2-异丙基苯胺，氧化酶组分限制了苯胺双加氧酶对2-异丙基苯胺的催化。因此，氧化酶组分在苯胺双加氧酶催化2-异丙基苯胺过程中发挥关键作用。
　　综上所述，本研究在大肠杆菌中重组表达和纯化了苯胺双加氧酶AtdA和AdoQTA1A2B的每一个组分。以苯胺或其中间产物γ-GA为底物，在去除谷氨酰胺氨基转移酶组分条件下，成功地在体外重构了有活性的苯胺双加氧酶。在研究决定苯胺双加氧酶底物特异性的关键组分时，发现谷氨酰胺合成酶的底物特异性在苯胺双加氧酶催化对甲基苯胺、邻甲基苯胺中发挥关键作用，而氧化酶的底物特异性在苯胺双加氧酶催化2-异丙基苯胺中发挥关键作用。此外，本研究也发现谷氨酰胺合成酶和氧化酶的底物特异性共同决定着苯胺双加氧酶对4-异丙基苯胺的催化。因此，推测苯胺双加氧酶的底物特异性由谷氨酰胺合成酶和氧化酶组分决定。由于许多苯胺衍生物难以被降解，如3，5-二氯苯胺，本研究的发现为定向进化苯胺双加氧酶，拓宽其底物谱提供了参考。