新近研究显示炎症反应在脑出血（Intracerebral hemorrhage,ICH）继发性损伤中发挥着重要作用,控制过度的炎症反应可以促进脑出血后血肿吸收及神经功能的损伤修复,但目前机制仍不甚清楚。既往研究多集中在ICH后致炎因子的作用,而对机体内源性抗炎机制关注较少。目前研究表明A20是机体重要的内源性抗炎功能基因,能有效阻断TLRs、IL-β、TNFR等炎症信号通路。但A20在脑出血继发性炎症损伤中的作用及机制尚未有相关报道。因此,本研究我们首先收集临床ICH病例,观察患者外周血A20的表达与患者神经功能损伤修复情况的相关性。在此基础上,利用A20敲除小鼠在体ICH模型,观察了A20基因敲除对小鼠ICH后血肿吸收、神经功能缺损及炎症反应的影响;然后,我们利用慢病毒载体介导的A20过表达小鼠模型,观察了A20过表达对ICH后血肿吸收、神经功能缺损及炎症反应的治疗作用。最后我们观察了E3泛素连接酶TRAF6在脑出血诱导的炎症反应中的作用,探讨了A20通过抑制TRAF6的聚泛素化在调控脑出血后血肿吸收及炎症反应的相关机制。第一部分:脑出血患者外周血A20mRNA表达及与患者预后关系的研究目的:观察急性期脑出血患者血浆中A20mRNA的表达变化及相应患者神经功能恢复情况,以明确A20表达与脑出血患者神经功能恢复的相关性。方法:收集49例急性脑出血患者（发病24h内）的外周血,并利用淋巴细胞分离液提取外周血中性粒细胞（PBMCs）,采用qRT-PCR的方法检测A20mRNA的表达变化,采用mRS评分法评价脑出血患者发病后3月时的神经功能缺损情况。同时收集49例性别与年龄相匹配的健康人作为对照。采用相关性研究方法分析外周血A20表达与患者mRS评分的相关性。结果:我们最终入组了34例急性脑出血患者,并提取外周血中性粒细胞（PBMCs）。qRT-PCR检测结果显示:与健康对照组比较,脑出血患者外周血PBMCs中A20mRNA明显升高。相关性分析结果提示:A20mRNA的表达与3个月时患者mRS评分值呈负相关关系.即在ICH急性期A20表达越高,患者预后越好,相反,急性期A20表达越低,神经功能缺损明显加重。结论:脑出血患者急性期血浆中A20mRNA表达升高,且升高程度与患者预后明显相关,提示A20可能参与了脑出血后神经功能损伤修复的病理过程。第二部分:A20在小鼠脑出血继发性损伤中的作用研究目的:观察小鼠脑出血后脑组织中A20的表达变化,及其对血肿吸收、炎症表达及神经功能损伤缺损的影响,从而明确A20在脑出血血肿吸收及继发性炎性损伤中的作用。方法:首先利用小鼠尾静脉血构建小鼠自体血脑出血模型,利qRT-PCR、Western Blot观察脑出血后不同时间点A20表达的变化;其次采用免疫荧光的方法,观察A20在血肿周围组织中哪种细胞中表达;再次利用A20敲除鼠脑出血模型,采用mRS评分、ELSA,TUNEL等方法观察A20^-/-后小鼠在血肿吸收、神经功能评分、炎症因子及神经元凋亡等方面的变化,以进一步明确A20在脑出血后血肿吸收及继发性炎性损伤中的作用。结果:与假手术组比较,脑出血后脑组织中A20表达明显增加,且在血肿周围组织中A20主要表达在小胶质细胞,其次为神经元,星形胶质细胞中A20的表达最少。A20^-/-组小鼠与WT组比较,血肿吸收显著减慢,血肿体积、血红蛋白含量明显增加。同时ICH后第1,3,7天,A20^-/-组脑水含量、神经功能评分显著高于对照组。在脑出血后第1,3,7天,与WT组相比,A20^-/-组炎症因子:IL-1β,IL-6,TNF-α表达显著增加。进一步地,与WT组比较,A20^-/-组小鼠脑出血后各个时间点生存率明显下降。与此同时,与WT鼠比较,A20^-/-鼠TUNEL染色阳性细胞数明显增加。结论:1.A20在脑出血后脑组织中表达显著增高,提示A20可能参与了脑出血的病理过程。而且A20主要在血肿周围组织中的小胶质细胞及神经元中表达。2.A20^-/-组小鼠血肿吸收能力显著下降,促炎因子表达增加,神经功能评分及死亡率增加,神经元凋亡增加,提示A20在脑出血后血肿吸收及神经功能损伤修复过程中起重要作用,A20可能为治疗脑出血的一个新靶点。第三部分:外周血A20在小鼠脑出血继发性损伤中的作用研究目的:观察外周血A20对小鼠脑出血后血肿吸收及炎症反应的影响方法:构建WT-A20^-/-鼠并联体模型,在并联3周后采用免疫荧光方法检测并联体中A20^-/-受体小鼠外周血PBMCs中A20的表达。构建并联体小鼠脑出血模型,造模后第3天观察并联体中A20^-/-受体小鼠在血肿体积、脑含水量、炎症因子表达、神经元凋亡等的变化。明确外周血A20在脑出血后血肿吸收及炎症反应中的作用。结果:免疫荧光结果提示:与A20^-/-组小鼠比较,WT-A20^-/-并联体中受体A20^-/-小鼠外周血PBMCs中A20阳性细胞数明显增加。并且A20阳性细胞数与WT组、WT-WT并联组小鼠无显著差异,表明WT-A20^-/-并联体模型构建成功。并联21天后造ICH模型,与A20^-/-组小鼠比较,受体A20^-/-组小鼠脑出血后第3天血肿吸收增加,脑含水量下降,炎症因子分泌明显减少。且血肿周围脑组织神经元凋亡数量明显减少。而与WT组、WT-WT并联组比较,受体A20^-/-组小鼠在血肿体积、脑含水量以及炎症因子IL-1β、TNF-a的分泌仍显著增加。结论:1.WT-A20^-/-鼠并联后,A20^-/-受体小鼠外周血PBMCs中A20表达上调,表明WT-A20^-/-鼠并联体模型构建成功。2.与A20^-/-组小鼠比较,受体A20^-/-组小鼠血肿吸收增加,脑含水量下降,炎症因子分泌明显减少,血肿周围脑组织神经元凋亡数量减少,提示外周血A20参与了脑出血血肿吸收及继发性炎性损伤。3.与WT组比较,受体A20^-/-组小鼠在血肿体积、脑含水量以及炎症因子IL-1β、TNF-a的分泌仍显著增加,提示外周血A20可能部分地参与了脑出血后血肿吸收及炎症反应的调控。第四部分:A20过表达在小鼠脑出血继发性损伤中的作用研究目的:观察过表达A20在脑出血后血肿吸收及继发性炎性损伤的作用。方法:构建A20慢病毒过表达载体,通过侧脑室注射3μl慢病毒载体,采用RT-PCR、Western-Blot、免疫荧光等方法检测各个时间点A20mRNA、蛋白的表达。确定A20过表达的最佳时间点后,进一步构建过表达A20小鼠脑出血模型,采用ELSA、mRS评分、TUNEL染色等方法观察过表达A20在脑出血后血肿吸收、炎症因子表达,神经功能评分、死亡率及神经元凋亡的变化。结果:注射A20慢病毒载体后A20表达逐渐升高,至7天表达最强烈。14d,28d虽有所下降,但仍维持在较高表达水平。同时,免疫荧光结果显示,A20与eGFP共标明显,且慢病毒诱导的A20主要在神经元与小胶质细胞中表达,星形胶质细胞表达则较少。与WT组比较,A20过表达组小鼠血肿体积、血红蛋白含量减小。同时A20过表达组小鼠ICH后1d,3d,7d脑含水量显著低于WT组.同样,A20过表达组小鼠炎症因子IL-1β,IL-6,TNF-α分泌明显减少。同时生存分析提示,与WT组比较,A20过表达提高了小鼠脑出血后的生存率;进一步地,与WT组比较,A20过表达组小鼠血肿周围组织神经元凋亡明显减少。结论:1.慢病毒载体能够过表达A20,且过表达A20主要在神经元及小胶质细胞中表达。2.过表达能够促进脑出血后血肿吸收及脑出血后继发性炎性损伤的修复。提示A20可能为脑出血治疗的新靶点。第五部分:A20调控TRAF6聚泛素化在脑出血诱导的炎症反应中的作用及机制研究目的:观察E3泛素连接酶TFAF6在脑出血后血肿吸收及炎症反应中的作用,明确A20通过抑制TFAF6介导的聚泛素化而调控脑出血诱导的炎症反应。方法:构建TRAF6 shRNA,在小鼠侧脑室注射TRAF6 shRNA,7d后造脑出血模型,取造模后1d,3d,7d小鼠脑组织,采用Western-blot、ELISA等方法检测各时间点NF-κBp65及炎症因子的表达。分别构建WT鼠、A20^-/-鼠、及A20过表达鼠的脑出血模型。采用Western-blot、CO-IP、EMSA、ELSA等方法,观察A20^-/-组、WT组、A20过表达组及空载体组的TRAR6介导的聚泛素化改变,以及各组NF-κBp65及炎症因子的表达变化。结果:与对照组比较,TRAF6 shRNA组TRAF6蛋白表达降低。同时,TRAF6 shRNA组小鼠ICH后脑含水量减少,神经功能评分降低,NF-κBp65及炎症因子IL-β、IL-6、TNF-α表达降低。A20^-/-组小鼠脑出血后A20泛素相关作用蛋白RNF11、TAX1BP1与TRAF6相互作用减少,而E2酶Ubc13、UbcH5c与TRAF6相互作用增加,下游NF-κBp65表达增加。相反,A20过表达组小鼠脑出血后RNF11、TAX1BP1与TFAF6相互作用增加,而E2酶Ubc13、UbcH5与TRAF6相互作用减少,下游NF-κBp65表达减少。结论:1.抑制E3泛素连接酶TRAF6的表达能够减轻脑出血诱导的炎症反应。2.脑出血后TRAF6介导的聚泛素化增加,A20能够抑制脑出血中TRAF6介导的聚泛素化。3.A20可能通过抑制TRAF6介导的聚泛素化从而减轻脑出血后继发性炎症反应。本研究在临床研究的基础上,观察了A20在脑出血血肿吸收及继发性炎性损伤中作用,同时探讨了A20通过调控TRAF6介导的聚泛素化进而抑制脑出血诱导的炎性损伤。进一步明确了A20在血肿吸收及炎症反应中的调控机制,也为通过内源性A20治疗脑出血提供了实验依据,可望为脑出血的治疗提供新靶点。