课题背景:在全球范围内,癌症作为致死性极高的疾病,成为一大研究热点。直至2020年,肝癌患病率及死亡率排名位于全球的第6位及第3位。与其他癌症相比,肝癌极易发生转移,这也导致多数患者在发现或是确诊时已为晚期,使得肝癌患者总体生存率降低、病死率高。同时,肝癌的治疗选择十分有限,目前最有效的手段依旧是手术切除及化疗,因此,寻找能够治疗癌症提高患者的生存率的有效药物迫在眉睫。萘内酰胺类衍生物作为小分子抗肿瘤药物是目前研究的一大热点,它能够破环癌细胞DNA导致肿瘤细胞死亡,并且具有良好的光学特性。而多胺类化合物可以利用多胺转运通道将药物运输到肿瘤细胞内,同时多胺作为抗肿瘤化合物的修饰物能够使化合物机制多样化,由于多胺在抗肿瘤方面具有优良特性,使之在肿瘤领域的研究越来越多。实验目的:本课题以肝癌为研究对象,探究萘内酰胺多胺缀合物R4在肝癌细胞中的作用及分子机制。实验方法:MTT法、平板克隆法检测R4对肝癌的抗增殖情况;AnnexinⅤ/PI染色法及MDC染色法检测R4诱导肝癌细胞凋亡以及自噬小体增多的情况;免疫印迹法检测R4对肝癌细胞中Caspase3、Caspase8、p62以及LC3蛋白表达量的影响;划痕法、Transwell法,检测R4对两株细胞迁移能力能力的影响;外加亚精胺（Spermidine,Spd）来检测R4与Spermidine竞争PAT转运系统;分子动力学模拟（MM MD）、结合自由能计算（MM/GBSA）以及拉伸分子动力学（SMD）等方法初步确定R4靶点;免疫荧光法、蛋白印迹法检测R4对PPT1蛋白水平的调控;DND189染色法检测溶酶体酸性;MTT法、流式细胞术及免疫印迹法验证PPT1为R4的潜在靶点。实验结果:本课题组合成了8个“萘内酰胺-多胺”缀合物,通过MTT法进行活性筛选,可以发现R4对肝癌有明显的活性抑制且呈剂量和浓度依赖性,其对肝癌细胞Hep G2、SNU739的IC50分别为Hep G2（4.85±0.12）、SNU739（3.77±0.047）,此外通过平板克隆实验显示随着浓度增加,R4可以明显抑制肝癌细胞的集落形成。AnnexinⅤ/PI染色及MDC染色结果显示R4能够诱导肝癌细胞凋亡以及自噬小体增多,该作用可能通过调控凋亡蛋白Caspase3、Caspase8,以及自噬小体标记物p62、自噬蛋白LC3实现。Transwell实验、划痕实验发现R4具有抑制肝癌细胞迁移和运动能力。外加亚精胺处理后,R4与spermidine产生竞争性抑制,表明R4可能部分通过PAT系统转运进入细胞。同时根据细胞器定位发现R4与溶酶体的重叠性相对最好,接着采用CADD的方法初步确定PPT1可能是R4的潜在靶标。通过免疫荧光法、蛋白印迹法以及外加PPT1类似物Nt BHA等方法验证PPT1为R4的靶点。实验结论:综上,实验结果表明:萘内酰胺多胺缀合物R4能够经多胺转运通道转运至细胞,并定位于溶酶体,通过调控溶酶体蛋白PPT1对肝癌细胞的生长、死亡以及转移产生影响。本课题研究不仅对萘内酰胺多胺缀合物的抗肿瘤效果进行评价,而且对于已知定位的化合物,其靶点筛选的方法提供了有效的思路。