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腰椎间盘突出症(lumbar disc herniation,LDH)是临床常见疾病,也是神经根性疼痛(radicular pain,RP)的主要病因。主要表现为长期的痛觉过敏(hyperalgesia),痛觉超敏(allodynia)和自发性疼痛。此病发病率极高、覆盖人群广泛、患者易忽视病情导致长期慢性的神经根性疼痛,对人类正常的生产生活将产生巨大的不良影响,并形成相应的经济压力,影响身心健康,因此成为一个需要立即谨慎对待的社会经济问题。进一步分析且探究LDH诱导的神经根性疼痛的缘由与体系拥有推广的巨大临床价值。多年来,尽管国内外已经进行了大量研究,但RP的机制仍然有待明晰。Toll样受体(TLRs)是模式识别受体家族中(PRR)极为关键的组成部分。近些年来的免疫学文献报道发现TLRs不仅在先天性免疫中发挥着极其关键的作用,TLRs还可较好地协调获得性免疫。激活后的TLR4能够利用MAPK/NF-κB和NF-κB/IRF3等信号转导方式,表达各种炎性细胞组织从而出现炎症。TLR4在中枢神经系统(central nervous system,CNS)中的神经元、小胶质细胞(microglia,MG)等相关细胞中都有较多的表达,而表达最显著的是在MG中。参与先天免疫应答的TLR4是一种跨膜蛋白富含亮氨酸的重复结构域和细胞质信号结构域。与内源性或外源性配体结合,TLR4可能通过激活NF-κB或p38诱导促炎性细胞因子释放。据报道,TLR4拮抗剂可减轻神经损伤引起的痛觉过敏或其辅助因子CD14导致的遗传缺陷胶质细胞活化和炎性疼痛。然而,TLR4在LDH引起的神经根性疼痛尚不清楚。本研究的目的是明确TLR4/NF-κB通路在神经根性疼痛中的作用,大鼠LDH模型的建立及脊髓小胶质细胞活化机制和随后的炎症反应的探讨。小胶质细胞作为CNS固有的免疫效应细胞,数量在CNS中尽管只占了大概十个百分点,然而其在生理或病理情况下调节CNS,免疫反应中拥有巨大的效果。当前的分析证实了,在普通人CNS内TLR4在脑与脊髓的血管内皮细胞、平滑肌细胞等各种组织中都比较活跃,同时在MG中的表现最为活跃。TLR4/NF-κB信号路径在CNS损伤中起到了十分巨大的效果,而MG为损伤介质的重要出处。在组织损伤时放出的内源性配体导致的过度炎症反应对神经系统的恢复将产生极大的不良影响。不仅会生成促炎症细胞组织与趋化组织,被激活的MG也能生成各种自由基,包括氧自由基,进而对神经细胞带来不良影响。小胶质细胞中的TLR4在内毒素的影响下将带来活性氧,使得上皮细胞与内皮细胞开始死亡。LDH引起的慢性疼痛模型中,MG是如何激活的?激活的MG又如何引起慢性疼痛?具体机制如何?还值得进行深入研究。本研究的目的是:1.证实TLR4/NF-κB(P65)通路在大鼠腰椎间盘突出诱导的神经根性疼痛中的作用;2.探求TLR4/NF-κB介导的小胶质细胞的激活与脊髓炎症反应在神经根性疼痛中的关联及机制。第一章脊髓TLR4/NF-κB通路的活化是LDH模型大鼠慢性疼痛产生的重要原因本研究用自体髓核(nucleus pulposus,NP)移植方法复制大鼠LDH模型。术后3-21d分别检测手术同侧和对侧后肢机械性撤足阈值(Paw withdraw threshold,PWT)和热撤足潜伏期(Paw withdraw latency,PWL)。发现:⑴与假手术组相比,NP植入大鼠表现为爪子退缩阈值(PWT)和爪子退缩潜伏期阈值(PWL)明显降低,而对侧后肢的PWT和PWL均无明显差异。这表明NP移植可引起单侧的机械性痛觉过敏和热痛觉超敏。运用western blotting方法和免疫荧光方法检测假手术组和NP移植(3d,7d,14d,21d)组大鼠同侧和对侧脊髓背角TLR4和p-p65的表达和细胞学定位。⑴western blotting检测发现,与假手术组相比,NP移植后3-21d同侧脊髓背角TLR4和p-p65的表达明显增加,但是对侧脊髓背角TLR4和p-p65的表达无明显差异。⑵免疫荧光双染结果发现脊髓背角TLR4主要存在于小胶质细胞,而不是在星形胶质细胞和神经元中。为了进一步证实TLR4/NF-κB通路的激活是慢性疼痛产生的原因,我们检测TLR4拮抗剂TAK242对脊髓p-p65表达的影响。结果表明:TLR4拮抗剂TAK242明显降低脊髓p-p65的表达,但对TLR4表达无影响。TLR4抑制剂TAK242和NF-κB抑制剂PDTC能有效减轻疼痛行为,抑制脊髓小胶质细胞的激活,减少脊髓炎性反应。以上结果提示脊髓TLR4/NF-κB通路的活化是LDH模型大鼠慢性疼痛产生的重要原因。第二章TLR4/NF-κB通路通过激活脊髓小胶质细胞并促进致炎细胞因子的表达引起RP由于TLR4主要存在于脊髓背角小胶质细胞,因此我们推断TLR4/NF-κB通路可能通过影响小胶质细胞的激活和功能,如致炎细胞因子的释放,从而引起慢性疼痛。结果表明:⑴ELISA检测发现,与假手术组相比,LDH大鼠脊髓中IL-1β、IL-6、TNF-α表达增加,IL-10表达降低。与LDH组相比,TAK242和PDTC组大鼠脊髓IL-1β、IL-6、TNF-α表达下降,IL-10表达上升。大量文献已经证实IL-1β、IL-6、TNF-α均可引起中枢敏感化和慢性疼痛。因此我们认为:NP移植后,脊髓背角TLR4/NF-κB通路的激活引起慢性疼痛的机制与促进小胶质细胞活化和致炎细胞因子释放有关。结论:1.NP移植引起大鼠同侧后肢机械性痛觉过敏和热痛觉超敏。2.脊髓背角TLR4/NF-κB通路活化是慢性疼痛产生的重要原因。3.脊髓TLR4/NF-κB通路通过促进脊髓小胶质细胞的激活和炎症反应参与神经根性疼痛,靶向这一途径可能有助于缓解神经根性疼痛。