[研究目的]我国是乙型肝炎病毒(HBV)高感染的国家之一。由HBV导致的肝癌死亡率高,手术治疗后5年生存率较低。显著提高治疗效果的有效手段是早期诊断。目前常用的肝癌实验初检方法是血清AFP含量测定。虽然AFP测定方法简单,但是一些慢性肝病AFP值也升高,使得AFP检测肝癌的特异性不高。研究发现,肝癌血清AFP蛋白发生高度岩藻糖基化,并且特异性高。检测这部分AFP(AFP-L3)可以大大提高肝癌诊断水平。因此,2005年美国FDA批准AFP-L3为肝癌诊断的唯一标志物。但是,鉴于约有一半肝癌患者血清AFP值为阴性,有必要进一步建立其他实验方法用来早期诊断肝癌。AFP-L3的发现提示我们,糖蛋白的岩藻糖基化与肝癌发生、发展相关。糖基化是最重要的蛋白质翻译后修饰之一,在许多疾病的发生、发展过程中,糖蛋白的糖基化程度或糖链结构都发生了改变,导致糖蛋白及其所在细胞的功能障碍,甚至出现恶性表型。而在肝癌中,岩藻糖基化变化可能不仅仅限于AFP。研究者发现,血清转铁蛋白、高尔基蛋白73等在肝癌中也发生了岩藻糖基化变化。说明肝癌血清中存在着许多岩藻糖基化异常的蛋白,而这些蛋白可能作为新的肝癌诊断标志物。根据小扁豆凝集素可以专一性捕获岩藻糖基化糖蛋白的原理,本研究应用基于小扁豆凝集素亲和的糖蛋白质组学技术,分析和鉴定肝癌血清中岩藻糖基化异常的糖蛋白质组,并验证其诊断肝癌的潜能。[研究方法]1应用基于小扁豆凝集素亲和的双向电泳技术分离鉴定肝癌相关血清岩藻糖基化糖蛋白：将肝癌组、慢性肝病组和健康人组血清标本各10例分别混合后,通过小扁豆凝集素微小亲和层析柱富集血清岩藻糖基化糖蛋白。应用双向电泳技术分离富集的蛋白,通过分析比较,找出差异蛋白点,然后应用质谱技术鉴定差异蛋白点,最后通过Western blot验证其中几个蛋白在各组血清中的岩藻糖基化情况。2应用基于小扁豆凝集素亲和的CLINPROT系统建立肝癌相关血清岩藻糖基化蛋白质指纹图谱模型：应用小扁豆凝集素磁珠富集肝癌组、肝硬化组、慢性肝炎组和健康人组血清标本中岩藻糖基化蛋白,通过飞行时间质谱技术检测富集的蛋白,建立各组岩藻糖基化蛋白质指纹图谱模型,软件分析后建立诊断模型,并进行盲法验证。3应用基于小扁豆凝集素亲和的CLINPROT系统建立肝癌相关血清岩藻糖基化肽指纹图谱模型：应用小扁豆凝集素磁珠富集肝癌组、肝硬化组、慢性肝炎组和健康人组血清标本中岩藻糖基化蛋白,取部分富集的蛋白进行胰酶酶解,然后将酶解后的多肽通过飞行时间质谱技术进行检测,建立各组岩藻糖基化肽指纹图谱模型,软件分析后建立诊断模型,并进行盲法验证。[结果]1差异蛋白鉴定和分析：通过双向电泳分离鉴定出22种血清蛋白质,其岩藻糖基化程度在肝癌组、慢性肝病组和健康人组中有明显差异。其中α-1-B糖蛋白、激肽原1、血液结合素等岩藻糖基化程度在肝癌组、慢性肝病组和健康人组中依次降低；相反,载脂蛋白H、补体因子H相关蛋白1等岩藻糖基化程度则在肝癌组、慢性肝病组和健康人组中依次升高。另外,肝癌组中角蛋白9、角蛋白10等岩藻糖基化程度高于慢性肝病组和健康人组；而健康人组中抗凝血酶Ⅲ、富含组氨酸糖蛋白、α-1-微球蛋白前体等岩藻糖基化程度高于肝癌组和慢性肝病组；补体C7和ATP依赖的RNA解旋酶DDX41岩藻糖基化程度则是肝癌组和慢性肝病组高于健康人组；RNA结合蛋白12岩藻糖基化程度则是慢性肝病组和健康人组高于肝癌组；α-2巨球蛋白和细小白蛋白a岩藻糖基化程度则是肝癌组和健康人组高于慢性肝病组。通过Western blot验证,α-1-B糖蛋白和岩藻糖基化α-1-B糖蛋白表达在肝癌组、慢性肝病组和健康人组之间没有显著差异(P>0.05)。而载脂蛋白H和岩藻糖基化载脂蛋白H表达在肝癌组、慢性肝病组和健康人组之间有显著差异(P<0.05),岩藻糖基化载脂蛋白H表达在三组之间差异更为明显(1：1.56：3.83)。2肝癌相关血清岩藻糖基化糖蛋白质指纹图谱模型建立和应用：将4组血清蛋白质指纹图谱模型进行各种配对的比较,建立一系列分类模型。分析模型后发现血清糖蛋白岩藻糖基化异常与肝癌发生、发展相关。经过盲法检测,从所有血清标本、慢性肝病和肝硬化中分别检出肝癌的灵敏度依次为74.07%、81.48%和88.89%,特异性依次为76.81%、83.72%和86.36%。将该系列诊断模型与AFP检测联用,肝癌诊断的灵敏度和特异性都得到显著提高,检测灵敏度依次为81.48%、88.89%和92.59%,特异性依次为88.41%、90.70%和95.45%。3肝癌相关血清岩藻糖基化肽指纹图谱模型建立和应用：将4组血清多肽指纹图谱模型进行各种配对的比较,建立一系列分类模型。分析模型后同样发现血清糖蛋白岩藻糖基化异常与肝癌发生发展相关。经过盲法检测,从所有血清标本、慢性肝病和肝硬化中分别检出肝癌的灵敏度依次为70.37%、77.78%和81.48%,特异性依次为69.57%、74.42%和81.82%。将该系列诊断模型与AFP检测联用,肝癌诊断的灵敏度和特异性都得到显著提高,则检测灵敏度依次为77.78%、85.19%和88.89%,特异性依次为88.41%、88.37%和90.91%。[结论]1血清糖蛋白岩藻糖基化异常与肝癌发生、发展有关。并且在肝癌发生、发展过程中,不同糖蛋白岩藻糖基化异常的表现形式不同,包括逐渐升高和逐渐降低等。2岩藻糖基化α-1-B糖蛋白不适合作为肝癌诊断候选标志物。3岩藻糖基化载脂蛋白H可作为潜在的肝癌早期诊断标志物。4肝癌相关血清岩藻糖基化蛋白质／肽指纹图谱模型具有肝癌早期诊断临床应用潜能。