研究背景：近年来,随着口腔种植外科技术提高和生物材料的发展,口腔种植学迅猛发展。然而,骨量不足仍然是种植义齿面临的一个主要问题,大量的牙种植病员都需行骨增量手术解决此问题。但骨增量的成功与否很大程度上依赖于骨代用品材料的引导骨再生的效能。因此,人们努力通过科学研究提高骨代用品的骨引导及骨诱导能力促进骨生成作用。骨形态发生蛋白2 (bone morphogenetic protein2, BMP-2)是已知的所有生长因子中对骨的形成作用最强的生长因子。然而,rhBMP-2作为酸性多肽,易在体液中快速扩散,也容易被蛋白酶所分解,治疗浓度难以维持,不能持续刺激靶细胞以充分发挥其诱导活性。学者们曾尝试通过提高rhBMP-2的使用剂量来促进成骨,然而,rhBMP-2的剂量太高,也会产生一系列并发症,可能导致组织肿胀、增加炎症反应的发生,阻碍了新骨形成；可能促进不期望的异位骨生成,还可在骨痂内形成囊肿样病变。而且,rhBMP-2的半衰期较短,价格昂贵。所以,目前的研究热点是将rhBMP-2吸附、粘接、载负于载体上,建立稳定的rhBMP-2释放系统,减少rhBMP-2的使用剂量,减少rhBMP-2的渗漏以提高植入位点局部浓度,降低并发症的发生率,使rhBMP-2的使用效能最优化。中国科学院Jianwu Dai等人发现：将一段含七个氨基酸的寡钛即胶原结合域(collagen-binding domain, CBD)和rhBMP-2的N端结合,形成具有胶原靶向结合能力的rhBMP-2,简称rhBMP2-h。C2C12细胞培养实验结果提示：rhBMP2-h的生物活性没有降低。体外胶原结合实验证实了rhBMP2-h能与胶原牢固紧密结合,而传统的rhBMP-2与胶原复合后经大量PBS冲洗时大部分rhBMP-2流失。在种植临床实践中,骨量不足特别是牙槽骨高度及宽度不足常导致种植体植入困难甚至无法植入,临床医生常用引导骨再生术实现牙槽嵴的骨增量。引导骨再生术是指用屏障膜维持手术建立的空间,阻挡增值快速的纤维组织的长入,以保证增值速度较慢的成骨细胞和血管从牙槽嵴顺着骨粉往上生长。临床上所用屏障膜主要是胶原膜,它起机械性阻挡和隔离的作用,不具备主动诱导作用,当临床上牙槽嵴缺损较多时,只从牙槽嵴顶往上成骨使骨增量效果欠佳。目的：鉴于以上的问题,本研究将具有与胶原靶向结合能力的rhBMP-2复合到胶原膜上,形成有骨诱导性的胶原膜,研究其在兔颅骨引导骨再生动物模型中的成骨效应,为有效使用生长因子提高成骨效应提供理论依据及实践参考。方法：1.用纯钛棒机械加工成一定规格的钛筒,充分抛光后进行多次超声及化学试剂表面清洗,分装、高温高压消毒、干燥备用。2.实验动物及分组：选用5-6月龄,体重为2.7-3.2kg,普通级雌性健康新西兰大白兔45只。实验动物分组：每只兔颅顶骨可植入四个钛筒,本实验四个处理组,分布在同一个动物身上。四个钛筒均装骨粉到肩台水平,A组：盖rhBMP2-h/胶原膜；B组：盖游离rhBMP-2/胶原膜；C组盖胶原膜；D组不盖膜。用45只新西兰大白兔进行造模实验,其中5只兔出现钛筒松动,不纳入统计分析。剩余40只兔完全随机分成1、2、3、4四个组,每组10只。第1组实验时间2周,第2组实验时间4周,第3组实验时间6周,第4组实验时间12周。每个时间段每个处理组有10个样本量。其中8个样本进行塑料包埋亚甲基蓝-酸性品红染色后做骨组织学观察和计量学分析,2个样本进行石蜡包埋HE染色行组织学观察。3.手术过程及动物模型建立：手术方法：每只兔的颅骨上制备四个环形骨裂隙,通过钛筒自身的螺纹旋转攻入骨内从而将钛筒固定,植入骨粉,四个钛筒顶端分别给予盖rhBMP2-h/胶原膜、游离rhBMP-2/胶原膜、胶原膜或者不盖膜。缝合关闭创口,术后3天均肌注青霉素40万单位以预防感染,单独喂养。于处死前13日、14日颈部皮下注射四环素,而处死前3日、4日颈部皮下注射钙黄绿素。40只实验动物分别于2、4、6、12周各处死10只,将钛筒连同颅骨完整取下并修整后以10%中性福尔马林固定,制作硬组织切片及石蜡切片。硬组织切片用亚甲基蓝-酸性品红染色,石蜡切片HE染色。骨磨片荧光显微镜下观察。亚甲基蓝-酸性品红染色的切片行组织形态学及计量学观察,通过图像测量软件获取相关实验数据资料,把不同组间的实验数据进行统计学对比分析后,得出相应的实验结论。HE染色行组织形态学观察。结果：1.实验动物术后生长恢复良好,各组动物均无死亡,伤口无炎症无裂开,每只兔植入4个钛筒,45只兔共植入180个钛筒,有五只兔共12个钛筒出现松动,钛筒松动率为6.7%。2.大体标本观察：切开白兔头部皮肤可见纤维软组织将钛筒紧密包裹,钛筒与骨面嵌合良好,稳固无松动脱落,钛筒周围颅骨骨面骨膜,肌肉重新附着,纤维组织由钛筒顶端包裹整个钛筒。3.荧光显微镜下观察：新生骨质因附着了荧光染色剂而发出绿色及黄色荧光,各组样品间新生骨质形成的荧光高度和面积对照清晰,可比性良好。2周时各组新生骨发出的荧光无明显差别；4周时rhBMP2-h/胶原膜组钛筒上层出现荧光,新生骨发出的荧光总量较其余三组稍多；6周时rhBMP2-h/胶原膜组钛筒上层荧光明显增多,荧光总量也比其余三组多；12周时rhBMP2-h/胶原膜组钛筒内荧光分布较其余组广泛,荧光总量较其余三组多。4.光学显微镜下观察：亚甲基蓝-酸性品红染色后可见新生骨从骨面或软组织一方向钛筒内长入,成熟的骨质被染成深红色,而类骨质和纤维组织等被染成紫蓝色。2周时新生骨量较少,四个组钛筒上层均未见骨小梁；4周时各组钛筒内都可见较多新生骨小梁,其中rhBMP2-h/胶原膜组钛筒上层有少量新生骨和类骨质,而其它三组不明显,rhBMP2-h/胶原膜组新生骨总量较其余三组稍多;6周时rhBMP2-h/胶原膜组在钛筒上层见到大量新生骨,且与颅骨骨面来源的新骨界限明显,其余三组未在钛筒上层见到明显骨小梁,rhBMP2-h/胶原膜组新生骨总量明显较其余三组多。12周时钛筒内部骨小梁生长高度增加,骨小梁增粗,钛筒顶端出现了骨吸收。rhBMP2-h/胶原膜组新生骨总量较其余三组多。HE染色可以可清晰地显示成骨细胞、成纤维细胞、纤维细胞、胶原等,可观察胶原膜、早期骨小梁,能分辨骨矿化不同阶段。2周时可见rhBMP2-h/胶原膜组、游离rhBMP-2/胶原膜组及胶原膜组钛筒上层的胶原膜未完全降解,rhBMP2-h/胶原膜组膜内长入血管和成纤维细胞较其余两组多,空白组钛筒上层全部为纤维组织。4周时胶原膜基本被降解吸收完全,在rhBMP2-h/胶原膜组的钛筒上层有较多类骨质和血管组织,而在其余三组的相似部位可见大量纤维组织。6周时rhBMP2-h/胶原膜组钛筒上层有大量骨小梁密集,骨小梁上沿较多成骨细胞及血管生成,而在其余三组类似部位未见明显骨小梁密集带,见纤维组织长入钛筒。12周时rhBMP2-h/胶原膜组钛筒上层为大量成熟骨小梁。骨小梁几乎长满整个钛筒,而其余三组的钛筒上层为大量纤维组织。5.统计分析结果：经析因方差分析,结果显示不同时间段间差异有统计学意义(F=68.097,P=0.000)；不同处理组间差异有统计学意义(F=13.868,P=0.000)；不同时间段和不同处理组两因素间有交互作用(F=2.008,P=0.045)。这说明各处理组的差异在不同时间段不一样,即不同的BMP结合方式、有无BMP的各组间的差异在2、4、6、12周不一样,故有必要分别于每一时间段对四个处理组进行比较。其中,2周时rhBMP2-h/胶原膜组、游离rhBMP-2/胶原膜、胶原膜和空白组新生骨面积占整个钛筒面积的百分比为(2.45±1.88)%、(2.18±1.81)%、(1.62±1.01)%和(1.79±2.04)%。方差分析结果显示差异无统计学意义(F=0.372,P=0.774)。4周rhBMP2-h/胶原膜组、游离rhBMP-2/胶原膜、胶原膜和空白组新生骨面积百分比为(7.53±2.80)%、(6.54±2.28)%、(5.97±2.93)%和(4.74±1.51)%,方差分析结果显示差异无统计学意义(F=1.810,P=0.168)。6周rhBMP2-h/胶原膜组、游离rhBMP-2/胶原膜、胶原膜和空白组新生骨面积百分比为(12.29±2.42)%、(8.40±3.62)%、(7.03±1.17)%和(6.27±1.89)%。方差分析结果显示差异有统计学意义(F=9.619,P=0.000)。进一步进行两两比较：rhBMP2-h/胶原膜组>游离rhBMP-2/胶原膜组≈胶原膜组≈空白组。12周rhBMP2-h/胶原膜组、游离rhBMP-2/胶原膜、胶原膜和空白组新生骨面积百分比为(16.50±4.75)%、(11.34±4.72)%、(10.01±2.18)%和(9.12±4.06)%。方差分析结果显示差异有统计学意义(F=5.279,P=0.005)。进一步进行两两比较：rhBMP2-h/胶原膜组>游离rhBMP-2/胶原膜组≈胶原膜组≈空白组。结论：1.兔颅骨引导骨再生动物模型能提供稳定的空间观察骨代用品的成骨效能。改进后的引导骨再生动物实验模型钛筒顶端置生物膜,与临床接近,且此动物模型操作方法简便,创伤小,所得的实验结果可靠性好,可比性强。2.将具有胶原靶向结合能力的rhBMP-2复合到胶原膜后,形成了新型的有骨诱导性的胶原膜。它既可防止纤维组织的长入,维持骨生长空间,又有骨诱导作用,能持续释放rhBMP-2使钛筒上层大量新骨生成,6周后rhBMP2-h/胶原膜组新生骨量远远大于其余三组。3.rhBMP2-h/胶原膜组比游离rhBMP-2/胶原膜组体现了更好的rhBMP-2诱导成骨。