论文部分内容阅读
目的:观察肢体缺血再灌注造成心肌细胞形态学变化及凋亡情况，Sirt1和自噬相关蛋白LC-3的蛋白表达，探索Sirt1和自噬在肢体缺血再灌注致心肌损伤中的作用机制，及七氟醚对心肌的保护作用。 方法:取49只SD大鼠（雄性，8周龄，体重200g～250g），随机分为7组（n=7）:假手术组（S组），肢体缺血再灌注组（IR组），肢体缺血再灌注预处理组（IPR组），七氟醚处理组(Sev组)，烟酰胺（Nicotinamide）抑制剂处理组（NAM组），3-MA抑制剂处理组（3-MA组），NAM+3-MA抑制剂处理组（NAM+3-MA组）。 每组大鼠予正常饮食和水饲养7天，NAM组和NAM+3-MA组术前7天每天腹腔注射10％的Nicotinamide，3ml/kg，其余组予3ml/kg的生理盐水。3-MA组和NAM+3-MA组术前半小时腹腔注射10％的3-MA1.5ml/kg，其余组予1.5ml/kg的生理盐水。 假手术组（S组）:使用4％的水合氯醛6ml/kg维持麻醉至无体动反应后行气管插管，机械通气，仅钝性分离双侧腹股沟三角处动脉不予夹闭。 肢体缺血再灌注组（IR组）:麻醉后气管插管，采用无创动脉夹双侧夹闭股动脉缺血4小时，再灌注4h的方法制作模型。 肢体缺血再灌注预处理组（IPR组）:股动脉夹闭前30分钟实施缺血5分钟，再灌注5分钟，循环3次后余同I/R组。 Sev组、NAM组、3-MA组、NAM+3-MA组全程吸入七氟醚，余同I/R组。 实验结束后取心尖部组织制备石蜡标本，石蜡标本切片后行HE染色观察细胞形态和TUNEL法检测心肌细胞凋亡情况，另取心尖部组织免疫印记法检测Sirt1和LC-3蛋白的表达情况。 结果:1.大鼠心肌Sirt1与LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ蛋白表达情况 与S组相比，IR组、IPR组、Sev组Sirt1表达上调(P＜0.05);与IR组相比，IPR组Sirt1表达无明显统计学意义(P＞0.05)，Sev组Sirt1表达下调(P＜0.05);与Sev组相比，NAM组、NAM+3-MA组Sirt1表达下调(P＜0.05)，3-MA组Sirt1表达差异无明显统计学意义（P＞0.05）。 与S组相比， IR组、IPR组、Sev组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达上调(P＜0.05);与IR组相比，IPR组、Sev组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达下调（P＜0.05）;与Sev组相比，3-MA组、NAM+3-MA组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达下调(P＜0.05)，NAM组LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ表达上调(P＜0.05)。 2.TUNEL法测细胞凋亡结果 与S组相比，IR组、IPR组、Sev组、NAM组、3-MA组、NAM+3-MA组细胞凋亡比例明显增高（P＜0.05）;与IR组相比，IPR组、Sev组细胞凋亡降低(P＜0.05);与Sev组相比，3-MA组细胞凋亡比例降低（P＜0.05），NAM组细胞凋亡比例增高(P＜0.05)，NAM+3-MA组细胞凋亡差异无明显统计学意义（P＞0.05）;与3-MA组相比，NAM+3-MA组细胞凋亡比例增高（P＜0.05）。 3.HE染色结果 S组心肌纤维排列整齐，细胞界限清晰，心肌间质无或仅有少量中性粒细胞渗出;IR组细胞界限不清，心肌细胞出现颗粒变性、空泡变性，胞浆疏松透明，部分心肌纤维断裂，心肌间质较多中性粒细胞和红细胞浸润。IPR组心肌纤维排列整齐，细胞界限模糊，心肌间质仅有少量中性粒细胞渗出及红细胞浸润;Sev组、3-MA组、NAM+3-MA组、NAM组心肌组织HE染色结果与IPR组无明显差异。 结论:1.肢体缺血再灌注增加心肌LC3蛋白表达，导致心肌细胞凋亡，心肌损伤。Sirt1减轻肢体缺血再灌注心肌的自噬作用，降低心肌细胞凋亡。 2.七氟醚减少LC3蛋白表达，减轻心肌细胞凋亡，减轻肢体缺血再灌注心肌损伤，但较肢体缺血预处理所致的心肌保护作用弱。