【摘 要】
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竞争性内源结合RNA(competing endogenous RNAs,ce RNA)通过与m RNA竞争性结合miRNA发挥对m RNA转录后调控的作用。现今对于非编码RNA在山羊附睾头组织中的调控作用了解甚少,因此对山羊附睾头中ce RNA调控机制的研究可对理解山羊附睾头发育、改善附睾内精子成熟奠定理论基础。本研究将利用全转录组基因克隆、高通量测序及生物信息学方法预测得到测序样品中差异ce
【基金项目】
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国家自然科学基金(No.31572407); 三晋学者支持计划专项经费(2016);
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竞争性内源结合RNA(competing endogenous RNAs,ce RNA)通过与m RNA竞争性结合miRNA发挥对m RNA转录后调控的作用。现今对于非编码RNA在山羊附睾头组织中的调控作用了解甚少,因此对山羊附睾头中ce RNA调控机制的研究可对理解山羊附睾头发育、改善附睾内精子成熟奠定理论基础。本研究将利用全转录组基因克隆、高通量测序及生物信息学方法预测得到测序样品中差异ce RNAs调控机制及其谷胱甘肽过氧化物酶5(Glutathione Peroxidase 5,GPx5)基因在谷胱甘肽通路中的ce RNA网络。通过双荧光报告素酶报告系统验证chi-miR-542-3p与潜在靶基因GPx5、异柠檬酸脱氢酶1(Isocitrate dehydrogenase 1,IDH1)和lnc RNA-MSTRG.57825.2的结合情况。最后通过过表达和抑制表达chi-miR-542-3p,对chi-miR-542-3p在太行山羊附睾头上皮细胞中的抗氧化功能进行了探究。研究结果如下:(1)对太行山羊附睾头GPx5基因进行克隆,克隆出CDS全长660 bp,5′-UTR 59bp,3′-UTR 690 bp。基于GPx5基因克隆菌液测序和全转录组高通量测序数据结果进行生物信息学分析,构建了太行山羊附睾头及附睾头谷胱甘肽通路ce RNA网络,ce RNA网络显示GPx5、IDH1和lnc RNA-MSTRG.57825.2、可以竞争性靶向结合chi-miR-542-3p。最后对幼龄和成年太行山羊组织中的差异m RNA、lnc RNA和miRNA各挑选8个进行荧光定量PCR检测,结果表明本次高通量测序结果较为可靠。(2)双荧光报告技术结果表明,chi-miR-542-3p可显著降低含有GPx5-3′-UTR、IDH1-3′-UTR和lnc RNA-MSTRG.57825.2的双荧光报告载体的荧光强度。在体外分离培养得到太行山羊附睾头上皮细胞,在附睾头上皮细胞中过表达或沉默表达chi-miR-542-3p,发现chi-miR-542-3p的过表达后两个潜在靶基因GPx5和IDH1在m RNA水平表达量均显著下调,GPx5在蛋白水平表达也显著下调,同时显著降低了附睾上皮细胞的抗氧化能力。chi-miR-542-3p表达沉默的细胞则呈现相反的结果。总之,幼龄和成年太行山羊附睾头组织具有大量的差异ce RNA调控机制,初步表明chi-miR-542-3p可通过ce RNA机制调控IDH1和GPx5基因的表达,其具有调控太行山羊附睾头上皮细胞的抗氧化功能。研究结果可为解析miRNA以及lnc RNA对太行山羊附睾头发育以及精子成熟过程中的作用机制提供了科学依据。
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