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肾小管-间质纤维化是各种慢性肾脏疾病发展为终末期肾衰竭的共同途径,而肾小管上皮细胞转分化(EMT)是肾小管-间质纤维化发生发展的重要机制。在EMT的众多调节因子中,转化生长因子-beta (TGF-p)被认为是最主要的促纤维化因子。转化生长因子-beta介导的信号通路非常复杂,主要包括Smad信号途径和非Smad信号通路(p38MAPK、ERK、JNK、AKT/PKB、RhoA)本文研究的蛋白分子Erbin是LAP蛋白家族新成员,近期研究发现Erbin参与了TGF-β诱导EMT各种通路的串话,对Smad及ERK信号通路均具有负性调节作用。因此,我们推测Erbin与肾小管上皮细胞转分化之间存在密切关系,并可能参与肾脏间质纤维化的发生与发展。在本研究中,我们通过体内外实验探讨Erbin在肾间质纤维化中的表达变化和其对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的作用及具体机制。我们的研究结果表明：无论在大鼠5/6肾切除纤维化动物模型还是TGF-β诱导的肾小管上皮细胞转分化模型中,Erbin表达均明显上调。同时我们还发现高表达Erbin可抑制ERK信号通路和TGF-β1诱导的EMT进程,相反,抑制Erbin的表达则可增强ERK的磷酸化水平并促进TGF-β诱导的EMT进程,包括进一步抑制E-钙粘蛋白(E-cadherin)的表达,促进α-平滑肌蛋白(α-SMA)的表达和纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)的分泌。然而MEK1/2抑制剂U0126除可抑制ERK的磷酸化之外,还可有效阻断Erbin对TGF-β诱导EMT的调节作用。此外,我们的研究还发现在没有TGF-β刺激时,Erbin并不能调节ERK的激活和EMT的进程。综上：我们的研究结果表明Erbin在肾脏纤维化中反馈性表达上调,高表达Erbin可通过阻断TGF-β/ERK信号通路抑制TGF-β诱导的EMT进程。第一部分Erbin与肾脏间质纤维化之间的关系研究目的探讨Erbin在肾脏间质纤维化及转化生长因子beta1(Transforming growth factor betal, TGF-β1)诱导的大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E)转分化中表达量的变化。方法体内实验采用SD大鼠5/6肾切除法建立肾脏纤维化动物模型,收集并检测各组血清中Scr, BUN水平,Masson染色观察肾间质纤维化程度,免疫组化及Western blot检测Erbin的分布与表达。体外实验采用TGF-β1(10ng/ml)刺激NRK52E细胞72h建立上皮细胞-间充质转分化(EMT)细胞模型,光学电子显微镜观察NRK52E细胞形态变化,免疫荧光及Western blot检测E-钙黏蛋白(E-cadherin)和α-平滑肌肌动蛋白(α-SMA)蛋白表达变化,RT-PCR及Western blot检测不同TGF-β1刺激时间下Erbin的表达变化。结果体内实验假手术组大鼠肾功能正常,Masson染色未见肾间质纤维化,Erbin在肾小管表达较少；模型组中大鼠Scr(140.52±61.11)、BUN(34.23±7.66)明显高于假手术组Scr(33.96±7.28)、BUN(8.11±2.55),肾间质可见明显纤维化,Erbin在肾小管表达也明显增加,是假手术组的2.9倍。体外实验TGF-β1刺激72h后,NRK52E细胞形态向成纤维细胞转化,细胞形态变大、变梭,细胞-细胞间距明显增大；正常NRK52E表达E-cadherin,少量表达Erbin和α-SMA,而TGF-β1刺激后,NRK52E细胞E-cadherin表达明显减少,Erbin和α-SMA表达则增加,分别是对照组的2.3倍和2.8倍(P<0.05)；同时,TGF-β刺激诱导Erbin表达具有时间依赖性,Erbin表达在TGF-β刺激24h后开始升高,72h达到高峰；RT-PCR结果显示TGF-β1刺激72h后,Erbin mRNA水平也明显升高,是对照组的1.8倍。结论无论肾间质纤维化还是TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化中,Erbin表达均明显上调,提示Erbin与肾脏间质纤维化之间存在密切关系。第二部分Erbin对TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的作用研究目的探讨Erbin对TGF-β诱导的肾小管上皮细胞转分化的作用。方法用脂质体2000将含全长Erbin基因的质粒或空载体(Prk5-myc-Erbin、 Prk5-myc)转染至大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)48h,Western blot检测正常组、空载体转染组、Erbin转染组中Erbin、E-cadherin、α-SMA蛋白表达；在Erbin质粒转染24h后,给予10ng/ml TGF-β1刺激72h,Western blot及免疫荧光检测正常组、TGF-β刺激组、Erbin转染组、Erbin+TGF-β1刺激组中Erbin、 E-cadherin、α-SMA蛋白表达；ELISA检测上述各组中纤维连接蛋白(Fibronectin,FN)的分泌情况。同时,我们还根据Geenbank设计了人Erbin靶向性siRNA,用脂质体2000将Erbin siRNA转染至大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E细胞)72h后,Western blot检测正常组、Erbin siRNA转染组中Erbin、E-cadherin、α-SMA蛋白表达；在Erbin siRNA转染24h后,给予10ng/ml TGF-β1刺激72h,Western blot及免疫荧光检测正常组、TGF-β1刺激组、Erbin siRNA转染组、Erbin siRNA+TGF-β1刺激组中Erbin、E-cadherin、α-SMA蛋白表达和分布；ELISA检测上述各组中纤维连接蛋白(Fibronectin, FN)的分泌情况。结果与正常组和空载体转染组相比,Erbin质粒转染组中Erbin表达明显增强,但在没有TGF-β1刺激情况下,高表达Erbin对EMT标志物E-cadherin以及α-SMA表达并没有影响。给予TGF-β刺激后,细胞内E-cadherin表达减少,Erbin及α-SMA表达明显增强。而在Erbin转染组,TGF-β1刺激诱导EMT的作用明显减弱。免疫荧光结果显示TGF-β1刺激后,细胞连接处的E-cadherin表达明显减少,而Erbin转染组细胞连接处的E-cadherin较单独TGF-β1刺激组明显增加。ELISA结果显示TGF-β1刺激组FN的分泌较对照组明显增加,而Erbin质粒转染则可有效抑制TGF-β1对FN分泌的促进作用。同时,与Erbin高表达一样,在没有TGF-β1作用下,Erbin siRNA虽然可以有效沉默Erbin的表达,但并不能影响E-candherin及α-SMA的表达。而给予TGF-β1刺激后,Erbin低表达组E-cadherin表达较单独TGF-β1刺激组进一步减少,α-SMA则进一步增加。免疫荧光结果显示同时给予Erbin siRNA和TGF-β1刺激时,细胞连接处的E-cadherin表达较单独TGF-β1刺激组进一步减少。ELISA结果表明Erbin低表达可进一步增强TGF-β1对FN分泌的促进作用。结论高表达Erbin可以抑制TGF-β1诱导的EMT,而低表达Erbin则可以促进TGF-β1诱导的EMT进程。我们的研究结果表明Erbin在TGF-β1诱导的肾小管上皮细胞转分化中发挥重要的保护性作用。第三部分Erbin调节TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的信号机制研究目的探讨Erbin对TGF-β/Smad及TGF-β/ERK信号通路的调节作用,明确Erbin调节TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化的具体信号机制。方法用10ng/ml TGF-β1刺激NRK52E细胞(0、15min、30min、60min、120min、240min), Western blot检测不同时间点Smad2及ERK磷酸化水平；采用脂质体2000将含人全长Erbin基因质粒转染至大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK52E), Western blot检测TGF-β1刺激后Erbin高表达对细胞内p-Smad2、 p-ERK表达及Smad2/3复合物入核情况的影响。同时我们还采用脂质体2000将Erbin特异性siRNA转染至NRK52E,建立Erbin低表达的细胞模型,Western blot检测Erbin低表达对TGF-β/ERK信号通路的影响。为进一步检测明确ERK信号通路的激活为Erbin调节TGF-β1诱导肾小管上皮细胞转分化所必需,我们在TGF-β1刺激前1h,给予MEK1/2抑制剂U0126(1μM),Western blot检测正常组、TGF-β1刺激组、TGF-β1+U0126刺激组、Erbin siRNA+TGF-β1组、Erbin siRNA+TGF-β1+U0126组中p-ERK、t-ERK、Erbin、E-cadherin、α-SMA的表达变化,免疫荧光和ELISA分别检测上述各组中E-cadherin表达和纤维连接蛋白FN分泌情况。结果在NRK52E细胞中,TGF-β1刺激15min即可激活Smad2,30min达到高峰,然后随着刺激时间的延长p-Smad2逐渐失活。TGF-β刺激后,胞浆内Smad2/3复合物减少,核内Smad2/3复合物则明显增加。与单独TGF-β1刺激组相比,高表达Erbin并不能影响Smad2磷酸化水平和Smad2/3复合物入核情况。在Erbin对TGF-β1/ERK信号通路的研究中,我们发现TGF-β刺激30min即可激活ERK,60min时候ERK磷酸化达到高峰。高表达Erbin可有效的抑制TGF-β1刺激引起的ERK磷酸化；相反,Erbin低表达可显著增强TGF-β1刺激引起的ERK磷酸化。同时,在给予MEK1/2抑制剂U0126之后,无论Erbin低表达组还是单独TGF-β1刺激组,ERK磷酸化水平均可被有效的抑制。除此之外,我们还发现给予U0126之后, Erbin低表达加TGF-β1刺激组E-cadherin表达增加,α-SMA表达减少,细胞连接处E-cadherin表达明显升高,而纤维连接蛋白的分泌则显著减少。结论Erbin可以通过阻断TGF-β/ERK信号通路抑制TGF-β1诱导的EMT进程,而不影响TGF-β/Smad信号通路。我们的研究结果提示Erbin对EMT存在负性调节作用,可能对肾脏纤维化起到一定的保护作用,为我们临床治疗肾脏纤维化提供新的治疗靶点。