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背景: 食管癌是我国高发肿瘤,病理类型主要有2种:食管鳞状细胞癌(esophagealsquamouscell carcinoma,ESCC)和食管腺癌(Esophageal adenocarcinoma,EAC)。其中鳞癌是最主要亚型,也是预后最差的亚型。且我国食管癌大约90%以上是鳞状细胞癌。食管鳞癌近年来治疗方面进展缓慢,病程进展快,预后差,五年总体生存率仅10%左右。 近些年一些研究发现,遗传学和表观遗传学等异常变化在食管癌的发生发展机制中起到重要作用,其中DNA甲基化作为表观遗传学的重要机制之一,已经发现是食管癌发生过程中的高频事件,DNA甲基化引起基因的异常表达,进而参与肿瘤的发生,成为近年来的研究热点。因此,食管鳞癌中DNA甲基化的研究,更好的帮助我们探索新的临床治疗靶点,为其治疗提供新思路、新策略。 SOX(SRY-related high-mobility-group box)家族是一类与早期胚胎发育有关的核转录因子,成员都具有高度保守的HMG-box(high-mobility-group box)结合域。该家族与肿瘤干细胞的调控及肿瘤的发生密不可分。且研究发现,Sox30基因在肺癌中是一个新的受甲基化调控的肿瘤抑制基因,通过转录激活p53信号促进肿瘤的凋亡而发挥抑制功能。然而,Sox30基因在食管鳞癌中的表观遗传学变化及表达作用机制,鲜有报道。本研究拟对食管鳞癌中Sox30甲基化的检测,明确Sox30受甲基化调控的机制及与食管鳞癌预后的关系,探索它成为药物治疗靶点的可能性。 目的: 1、检测食管鳞癌细胞系中Sox30甲基化状态和表达情况。 2、检测食管鳞癌组织及食管炎组织中Sox30甲基化状态和表达的发生情况,并对其与临床病理数据资料之间的关系进行分析。 材料和方法: 1、采用甲基化特异性PCR(methylation specific PCR,MSP)的方法,检测Sox30基因在食管癌细胞系及食管鳞癌组织标本DNA中的甲基化情况。并利用亚硫酸氢盐修饰后测序法(bisulfite sequencing PCR,BSP)对Sox30的MSP分析结果进一步证实。 2、Western blot法检测食管癌细胞系和在甲基化转移酶抑制剂地西他滨处理后Sox30、p53的蛋白表达水平。 3、使用甲基化转移酶抑制剂5-aza-CdR处理食管癌细胞系,并利用QRT-PCR技术检测处理前后Sox30基因的表达情况。 4、对食管鳞癌及食管炎组织标本中Sox30蛋白的表达情况,进行免疫组化检测。 5、对食管鳞癌中Sox30基因甲基化及表达的情况与患者临床病理资料以及预后情况之间存在的关系进行统计学分析。 结果: 1、本研究分别选用了3种食管癌细胞系:KYSE30、KYSE510、KYSE9706,在DNA水平,Sox30基因启动子在KYSE30、KYSE510、KYSE9706中均发生了甲基化;基因测序结果显示:KYSE30、KYSE510、KYSE9706中Sox30基因启动子甲基化概率分别为97.1%、97.1%、98.6%。3种食管癌细胞株经过1μmol/L、2μmol/L、5μmol/L浓度的去甲基化药物5-Aza-CdR处理96h后,Sox30基因和蛋白较对照组均表达上调。数据分析显示,Sox30基因的甲基化水平越高,其在食管癌中表达越低,说明sox30沉默或下调与其甲基化密切相关。野生型p53基因和蛋白的表达较对照组变化不明显。 2、通过免疫组化的方法对37例食管鳞癌组织和6例食管炎组织中Sox30蛋白的表达水平进行了检测。实验结果显示,在37例食管鳞癌组织中,3例食管鳞癌组织表达Sox30蛋白,表达率为8.1%,6例食管炎组织中Sox30蛋白不表达,表达率为0,差异没有统计学意义(P>0.05)。在18例食管鳞癌组织样本中,Sox30基因在66.7%(12/18)的食管鳞癌组织样本中出现了甲基化,免疫组化结果显示,Sox30蛋白的表达率为5.6%(1/18),Sox30甲基化与Sox30蛋白表达没有显著差异(P>0.05)。 3、对Sox30蛋白表达与病人临床病理特征之间进行相关性分析,结果显示,在食管鳞癌组织标本中,Sox30蛋白的表达与食管鳞癌患者的性别、年龄、肿瘤长度、肿瘤部位和临床分期无明显的相关性(P>0.05)。 4、对Sox30基因甲基化状态和病人临床病理资料之间的关系进行分析,结果表明,Sox30基因的甲基化状态与患者性别、年龄、肿瘤部位、肿瘤长度和临床分期没有明显相关性(P>0.05)。 5、Sox30基因甲基化及表达与预后的分析。单因素分析显示,Sox30基因甲基化与食管鳞癌患者总生存期之间没有明显差异(P=0.179);Sox30基因甲基化与食管鳞癌患者无进展生存期之间具有显著差异(P=0.042)。单因素及多因素分析显示Sox30表达与预后无显著差异(P>0.05)。 结论: 1.Sox30甲基化是食管鳞癌的高频事件。 2.在食管鳞癌中,Sox30基因甲基化水平影响Sox30蛋白表达。 3.Sox30甲基化状态与食管鳞癌预后可能有关。 4.Sox30在食管鳞癌中的作用机制可能与p53信号通路无关。