论文部分内容阅读
研究背景心脏纤维化（Myocardial fibrosis,MF）不是某一种疾病,而是大多数心血管疾病伴随的病理生理学改变,是组织损伤所致的修复反应失调的结果。心血管疾病从代偿期恶化发展成为心力衰竭的过程中,MF是一个重要的转折点,MF会引起心脏收缩和舒张功能的下降,心脏电传导的异常和心肌灌注的减少,进而加速心力衰竭的发生。据统计,中国心血管疾病的现患人数约为3.3亿,但目前临床上尚缺乏针对MF的靶向药物。血管紧张素转换酶抑制剂（Angiotensin converting enzyme inhibitors,ACEI）类药物如卡托普利等被证实对MF有改善作用,但其疗效极其有限,无法逆转MF及心衰的进展。因此,进一步研究MF的发病机制,将有助于寻找有效的干预策略,为MF的防治提供更多的理论基础和实验依据。流行病学调查显示:患有高血压和动脉粥样硬化的患者MF程度有显著的性别差异,提示MF的发生发展与女性性激素相关。以往研究认为,导致绝经后妇女MF程度显著增加的主要原因是卵巢功能衰竭所致的雌激素水平低下。但是,绝经后雌激素治疗的总体效果仍存在争议,雌激素缺乏也并不能完全解释MF程度的增加。而与雌激素缺乏一起,高卵泡刺激素（Follicle stimulating hormone,FSH）浓度也被认为是更年期发生的标志。尽管FSH水平在绝经过渡期急剧上升,但从未有人研究过FSH对MF的直接作用。心脏成纤维细胞（Cardiac fibroblasts,CFs）是MF的主要效应细胞,这些细胞又被称为“前哨细胞”,因为它们可以感知心脏中化学、机械和电信号的变化并发出适当的反应。CFs的主要功能之一是调控细胞外基质（Extracellular matrix,ECM）的合成和降解,从而为心肌细胞和其他细胞提供三维网络,以维持适当的心脏形态和功能。CFs既是不同刺激的目标,又是不同刺激的来源。CFs分化为肌成纤维细胞（Myofibroblasts,Mys）是心脏重塑过程中纤维化形成的主要原因。Mys又被认为是CFs的活化状态,Mys通常出现在病理条件下,它们会分泌高水平的ECM相关蛋白,虽然最初是为了维持心脏结构完整性而发生的适应性变化,但这些过程最终会使心室结构和顺应性朝着不利方向发展。Mys独特的功能使其成为减少纤维化的可能靶标,因此更好地理解这些过程的潜在机制将为延缓心脏功能恶化带来希望。MF是一个动态可逆的过程,这对于深入了解调控纤维化进程的分子机制和利用这种固有可塑性进行干预具有重要意义。MF时ECM过度沉积,既可能是通过激活CFs导致ECM合成增多,也可能是通过抑制基质金属蛋白酶（Matrix metalloproteinase,MMPs）从而减少ECM的降解。研究表明,无论是CFs的激活还是MMPs的下调都受到Smad2/3的严格调控。本课题在细胞水平上探索高浓度FSH促进Smad2/3磷酸化的胞内信号转导通路,确认FSH促进CFs向Mys分化,上调ECM相关蛋白表达。并在主动脉弓缩窄（Transverse aortic constriction,TAC）诱导的压力超负荷小鼠中观察FSH促进MF的效应。研究目的阐释在心脏纤维化中观察到的性别差异,确认FSH促进心脏纤维化发生发展的效应,探讨FSH促进CFs分化,上调ECM相关蛋白的作用,从整体及细胞水平,揭示FSH促进心脏纤维化发生发展的内在作用机制。研究方法和结果第一部分:FSH上调p-Smad2/3促进心脏成纤维细胞分化为肌成纤维细胞不同条件下,FSH处理心脏成纤维细胞（CFs）,探究p-Smad2/3介导FSH促进CFs向Mys分化,上调ECM相关蛋白表达水平的作用。1.1 FSHR在心脏成纤维细胞中表达体外培养心脏成纤维细胞,RT-PCR和Western blot确认CFs中有FSHR的m RNA和蛋白表达。1.2 FSH上调心脏成纤维细胞中ECM相关蛋白的表达FSH可浓度依赖性（5m IU、10m IU、50m IU、75m IU、100m IU）和时间依赖性（6h、12h、24h、48h、72h）上调ECM相关蛋白COL1A1、COL3A1的表达（P＜0.05）。1.3 FSH促进了CFs向Mys的分化FSH可浓度依赖性（5m IU、10m IU、50m IU、75m IU、100m IU）和时间依赖性（6h、12h、24h、48h、72h）上调CFs中分化标志基因α-SMA的表达（P＜0.05）。免疫荧光结果显示FSH促进了CFs中α-SMA的表达。实时细胞分析仪（RTCA,x CELLigence）和CCK-8结果表明,FSH不促进CFs的增殖。1.4 FSH下调CFs中基质金属蛋白酶3的表达在培养的心脏成纤维细胞中,施加不同浓度的FSH（5、10、50,75,100m IU/m L）处理72 h,或者用FSH（100 m IU/m L）处理细胞6-72h。与对照组（CON）相比,基质金属蛋白酶3（MMP3）表达量逐渐减少（P＜0.05）。1.5 FSH通过Gαs/AC/c AMP/PKA激活p-Smad2/3为探究FSH促Smad2/3磷酸化的胞内信号转导通路,加入Gαs抑制剂NF499（10μM）、PKA抑制剂H89（10μM）预处理CFs 1h后,加入FSH（100 m IU/m L）作用72h,结果显示NF499和H89可抑制FSH诱导的p-Smad2/3表达。在CFs中转染si RNA敲低Smad2/3可抑制FSH的作用。采用ELISA法检测c AMP,FSH可上调c AMP的水平（P＜0.05）。第二部分FSH促进压力超负荷小鼠模型心脏纤维化的发展雌性C57BL/6J小鼠饲养在SPF级动物实验中心,按实验设计随机分为5组:a)假手术（Sham）组;b)主动脉弓缩窄（TAC）组;c)主动脉弓缩窄（TAC）+卵巢去势（OVX）组;d)主动脉弓缩窄（TAC）+卵巢去势（OVX）+补充雌激素E2组;e)主动脉弓缩窄（TAC）+卵巢去势（OVX）+E2+补充FSH组。17β-雌二醇缓释片0.25mg/60 days,皮下注射FSH 3 IU/day。2.1小鼠心功能参数测定为明确卵巢去势（OVX）手术和主动脉弓缩窄（TAC）手术的有效性,以及FSH对小鼠心脏功能的影响,运用Vevo LAZR-X小动物超声成像系统在左心室胸骨旁短轴切面B-Mode和M-Mode下记录心动周期,测定射血分数（Ejection Fraction,EF）和缩短分数（Fractional Shortening,FS）。手术后小鼠EF、FS均显著下降（p＜0.001）,提示动物模型建立有效。TAC+OVX+E2+FSH组与TAC+OVX+E2组相比,E2水平接近正常,仅为FSH升高,此时可以看到FSH明显降低了EF和FS（p＜0.01）。2.2 FSH促进小鼠心脏血管周围和心肌间质的胶原沉积FSH处理8周后处死小鼠取出心脏,对心脏石蜡切片进行Masson trichrome染色,计算心脏间质纤维化面积和血管周围纤维化面积。结果显示FSH明显促进了压力超负荷小鼠心脏血管周围和心肌间质的胶原沉积（p＜0.01）。结论高水平FSH通过Gαs/AC/c AMP/PKA激活p-Smad2/3;FSH既上调α-SMA的表达促进心脏成纤维细胞向肌成纤维细胞分化,又下调MMP3抑制胶原的降解,从而导致ECM相关蛋白表达增加,促进了心脏纤维化的发生发展。