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前言:Claudin-7是紧密连接蛋白Claudins的家族成员之一,参与维持细胞的极性和调节细胞间的渗透性,在食管癌和结肠癌中表达降低或缺失而在胃腺癌和卵巢癌中Claudin-7的表达较周围正常组织反而升高,但无论其表达升高还是降低都与肿瘤的发展有关。Slug是锌指转录因子Snail超家族成员之一,小鼠Slug和Snail具有高度的同源性,在N末端都含有SNAG反式转录区,C末端分别含有5个和4个锌指结构,功能获得和缺失实验表明Slug在鸡和爪蟾胚胎特定区域可以启动EMT(上皮-间质转化),并且通过与启动子上的E-box结合抑制E-cadherin、Claudin-1等其他紧密连接蛋白的转录。在脊椎动物中Snail抑制Claudin-7的转录活性不仅依赖于锌指区域,而且还依赖于N末端的SNAG反式转录区,而Slug与Snail在N末端具有高度同源性,都含有SNAG反式转录区,在人类Claudin-7启动子含有7个E-box,为Slug的结合提供了位点,那么本研究旨在初步探讨肺癌中Claudin-7和Slug的表达情况,及两者表达的可能相关性。
实验材料与方法:
1、材料收集101例原发性肺癌组织(鳞癌52例,腺癌49例)和40例正常肺组织,另外30例新鲜肺癌组织及癌旁肺组织均来自中国医科大学附属第一医院2004年8月至2010年5月外科手术切除标本。
2、主要试剂
浓缩型兔抗人Claudin-7多克隆抗体(34-9100)购自Invitrogen公司,兔抗人Slug多克隆抗体(bs-1382R)购自北京博奥森生物技术有限公司。
3、实验方法
(1)免疫组织化学
组织标本经10％中性福尔马林溶液固定,石蜡包埋,制成4gm切片。切片经二甲苯脱蜡,梯度酒精脱苯、水化后,采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶(S-P法)检测Claudin-7(1:200)和Slug(1:150)蛋白表达。细胞内呈现棕黄色细小颗粒者为阳性染色,每张切片在400倍镜下观察10个视野,每个视野计数100个肿瘤细胞。阳性细胞数≤10％为1分,11％-50％为2分,50％-75％为3分,≥75％为4分;再按染色强度评分:无色为0,淡色为1分,棕黄色为2分,棕褐色为3分;最后按照乘积分数分为4个等级:“-”(0,1,2),“+”(3,4),“++”(6,8),“+++”(9,12)。结果判定:分数≥3定为阳性,＜3为阴性。
(2)Western Blot
将含80μg总蛋白的组织裂解产物进行10％SDS-PAGE电泳后,50伏恒压转膜120分钟,脱脂奶粉室温封闭2h,经TTBS冲洗3次,抗Claudin-7抗体(1:300)、抗Slug抗体(1:300)和抗β-actin抗体(1:200),4℃孵育过夜后,辣根过氧化物酶标记二抗37℃孵育2h,TTBS洗三次后ECL发光。以β-actin为内对照,以β-actin为内对照,比较各条带灰度值。
4、统计分析
采用SPSS13.0统计学分析软件,对Claudin-7和Slug表达与临床病理因素的关系用x2检验;Claudin-7和Slug表达的关系采用Spearman等级相关分析,采用t检验分析Western blot图像灰度值。P＜0.05为有统计学意义。
结果:
1、免疫组化肺癌组织中Claudin-7的表达主要定位于细胞浆,少量定位于细胞膜和细胞核,在鳞癌和腺癌中的表达较正常肺组织明显减弱。Slug表达主要定位于细胞浆和细胞核,在鳞癌和腺癌中的表达较正常肺组织明显增高。两者表达水平均与肺癌组织分化程度、淋巴结转移明显相关,并且Slug还与TNM分期呈正相关,Claudin-7与Slug蛋白表达呈负相关。
2、Western blotClaudin-7在肺癌组织中的表达量明显低于配对癌旁肺组织,而Slug在肺癌组织的表达却显著高于癌旁肺组织。
结论:在肺鳞癌和腺癌中,Claudin-7与Slug的表达变化与肿瘤的进展密切相关,是判断其生物学行为,预测转移趋势极具价值的指标。Claudin-7蛋白表达下调与Slug的高表达有关。