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前言中枢神经系统(central nervous system,CNS)具有复杂的兴奋—抑制反馈机制,以维持其神经细胞膜的稳定性。谷氨酸(glutamic acid,GLU)和γ-氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid,GABA)正是哺乳动物中最具代表性的两类兴奋性,抑制性神经递质。GLU在谷氨酸脱羧酶(glutamic acid decarboxylase,GAD)作用下脱羧转化为GABA。研究表明,兴奋性和抑制性神经递质的失衡是导致癫痫发作的一个重要原因,当脑内GLU浓度过高或GABA浓度降低显著(≥40%)时即可引起自发性癫痫。自发性癫痫大鼠(spontaneously epileptic rat, SER)为双基因突变大鼠,Tremor (tm)大鼠杂合子(tm/+)和Zitter (zi)大鼠纯合子(zi/zi)杂交得到。生后8周,SER自发性地出现癫痫大发作和小发作,其对于抗癫痫药物的反应同癫痫患者类似,是研究遗传性癫痫的理想动物模型。Tremor作为SER的亲代,有很高的研究价值。本研究通过比较Tremor大鼠和正常Wistar大鼠海马中GLU和GABA两种氨基酸的含量的改变以及GLU向GABA代谢转化过程中的特异性酶—谷氨酸脱羧酶的两种亚型GAD65、GAD67在mRNA和蛋白水平的变化,为阐明癫痫的发病机制提供理论依据。材料与方法1、动物、试剂与仪器Tremor大鼠和正常Wistar大鼠13-15周龄,♀、♂不限,在标准条件下饲养(12小时交替照明,湿度为50%-70%,24℃),动物自由进食饮水,每组5只。TaKaRaRNA PCR Kit (AMV)试剂盒,羊抗兔GAD65、GAD67多克隆抗体(美国santa公司)。OPA(美国Amresco), Bradford法测定蛋白浓度试剂盒(普利莱基因技术有限公司)彩色预染蛋白质分子量标准(碧云天生物技术公司)。GLU、GABA标准品(sigma公司)。色谱级甲醇。美国Waters公司的HPLC色谱系统,包括600泵,2475检测器,Empower色谱工作站,C18-ODS色谱柱(Dima) PCR仪(美国Biometra), DYY-5型稳流稳压电泳仪电泳仪(北京六一仪器),Hoefer miniVE垂直电泳,凝胶成像系统(UVP,USA)低温高速离心机(Centrifuge5810R,德国Eppendorf)等。2、柱前衍生—高效液相色谱法检测Tremor大鼠及Wistar大鼠脑海马组织内GLU、GABA的浓度Tremor大鼠及Wistar大鼠经乙醚麻醉,断头,低温下进行脑海马剥离,低温冰上匀浆,匀浆液离心后取上清液,上清液经OPA衍生试剂衍生化后,用高效液相色谱检测其中GLU及GABA的含量。3、RT-PCR方法检测GAD65、GAD67 mRNA表达Trizol法提取Tremor和Wistar大鼠脑海马组织中GAD65、GAD67的总RNA,参照Takara AMV RT-PCR试剂盒说明书进行RT-PCR反应。产物经1.5%琼脂糖凝胶电泳后,扫描结果进行灰度分析。4、Western blotting方法检测GAD65、GAD67蛋白表达提取Tremor和Wistar大鼠脑海马组织中GAD65、GAD67蛋白,考马斯亮蓝法蛋白定量,经10%SDS-PAGE凝胶电泳后将蛋白转印至PVDF膜上,一、二抗孵育,ECL化学发光法显色。5、统计学分析各组结果以平均数±标准差表示,两组间比较用t检验。实验结果1、HPLC结果显示：Tremor大鼠脑海马组织中GLU含量为2242.0±100.1μg.g－1,GABA含量为530.8±28.4μg·g－1；Wistar大鼠脑海马组织中GLU含量为1801.5±37.1μg·g-1, GABA含量为420.9±17.9μg·g－1,Tremor大鼠与Wistar大鼠相比兴奋性氨基酸GLU的含量升高,GABA的含量也升高。两者皆有显著性差异,P＜0.01。2、RT-PCR结果显示：Tremor大鼠脑海马组织中GAD65、GAD67 mRNA与正常Wistar大鼠相比无显著性差异(P＞0.05)。3、Western blotting结果显示：Tremor大鼠脑海马组织中GAD65、GAD67蛋白的表达与正常Wistar大鼠相比无显著性差异(P＞0.05)。结论1、Tremor大鼠脑海马组织中GLU含量相对Wistar大鼠升高,该结果提示在Tremor鼠中GLU的升高是引起癫痫发生的原因之一。2、Tremor大鼠脑海马组织中GABA含量升高,该结果提示Tremor鼠中GABA的升高是癫痫发生后机体的一种代偿性神经保护机制。3、Tremor大鼠脑海马组织中GAD65、GAD67 mRNA及蛋白水平的表达与正常Wistar大鼠相比无统计学差异。