基于转录组测序的苹果果实叶绿素降解相关基因筛选及MdSGRL基因功能分析

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果实色泽是苹果果实重要的外观品质指标,影响果实的商品性和价值。苹果果实在成熟过程中,伴随着叶绿素的降解,从而导致果实褪绿变黄。为探究苹果果皮叶绿素降解代谢机理,本研究选取两个不同着色苹果品种(‘澳洲青苹’和‘金冠’)成熟果皮为试验材料,对其进行转录组测序分析,根据转录组结果从中挖掘苹果叶绿素降解关键基因,并对关键基因的完整开放阅读框(ORF)c DNA序列进行克隆与功能分析。主要研究结果如下:1.利用RNA-seq技术完成‘澳洲青苹’和‘金冠’苹果成熟果皮转录组测序。在构建的GDY和GSG c DNA文库中,分别获得了48206940和48796646条高质量序列,从中鉴定出9632个DEGs,上调基因5011个,下调基因4619个。其中有1206个DEGs被富集到118个KEGG代谢通路上,显著富集在光合作用(mdm00195)、光合作用天线蛋白(mdm00196)、碳代谢(mdm01200)、植物激素信号(mdm04075)和淀粉和蔗糖代谢(mdm00500)等通路上。预测的转录因子共计3258个,属于428个转录因子基因家族。随机选取9个基因进行q RT-PCR分析,结果与转录组测序结果一致。2.成功克隆Md SGRL基因,并进行了生物信息学分析。Md SGRL完整开放阅读框(ORF)c DNA序列为750 bp,编码249个氨基酸,属于Staygreen超家族。理化性质分析表明,分子质量为28.22 k Da,理论等电点p I为9.10,属于亲水性蛋白。同源性分析,Md SGRL与秋子梨同源关系最近。启动子分析该基因启动子区域包含低温、光响应响应元件和脱落酸、茉莉酸甲酯响应元件等诱导型顺式作用元件,说明Md SGRL基因可能受环境和激素等多种因素的调控。Md SGRL亚细胞定位结果显示,该蛋白定位于叶绿体。3.成功构建植物超表达载体p CAMBIA2301-Md SGRL,利用农杆菌介导注射法对烟草叶片和苹果果皮进行注射侵染,分析Md SGRL的生物学功能。结果表明,超表达Md SGRL的烟草叶片呈现绿色,而对照的烟草叶片出现黄化的现象;超表达Md SGRL烟草叶片的净光合速率、胞间CO2、气孔导度、蒸腾速率、Fo、Fv、Fm、Fv/Fm均显著高于对照;超表达Md SGRL烟草叶片的衰老相关基因Nt SAG、Nt NCED、Nt AAO和叶绿素降解相关基因Nt PAO、Nt NYC1、Nt PPH、Nt RCCR的表达量均显著下降。苹果中超表达Md SGRL的区域果皮颜色呈绿色,而对照果皮颜色由绿变黄;超表达Md SGRL导致叶绿素降解关键基因Md PAO表达量显著下降。上述结果表明超表达Md SGRL可负调控苹果果皮叶绿素降解代谢,抑制或减缓叶绿素的降解,使叶片和果皮呈现“滞绿”的现象。研究结果为进一步研究苹果果实色泽调控机制提供了理论支撑。
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