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甘露糖结合凝集素(Mannose-binding lectin, MBL)是存在于血清中的一种模式识别分子,可识别并结合多种微生物及凋亡细胞的表面特定己糖如甘露糖、N-乙酰葡糖胺等的一种宿主非特异性凝集素。已有研究表明MBL可通过结合季节性流感病毒表面的HA、NA发挥明确的抗病毒功效,但其对近年来新发、跨种属传播并感染人的禽流感病毒的效应尚不清楚。2013年,一种新型的可感染人的H7N9亚型流感病毒在我国出现,患者表现为严重肺炎、呼吸窘迫综合征,死亡率达40%之多。该病毒HA类似2012年浙江鸭中分离到的H7N3病毒,NA类似2011年韩国野鸟H7N9分离株,内部6个基因片段同2012年禽中流行的H9N2病毒高度同源。本文使用重组人甘露糖结合凝集素(rhMBL)对分别带有A/Anhui/1/2013(H7N9)、A/Hongkong/33982/2009(H9N2)表面HA、NA,内部基因为A/Puerto Rico/8/1934(H1N1)(PR8)的重配病毒(H7N9Vac和H9N2RG)及季节性流感毒株A/Brisbane/10/2007 (H3N2)进行相互作用及体外感染干扰试验。首先采用酶联免疫法(ELISA)、血凝抑制实验(HI)、神经氨酸酶抑制实验(NAI)来研究rhMBL对病毒表面糖蛋白HA、NA的结合及对其功能影响。其次我们进行了rhMBL对病毒一轮和多轮感染宿主靶细胞的影响,采用FITC标记的病毒,研究了感染早期,rhMBL对流感病毒与易感靶细胞(狗肾上皮细胞,MDCK)的结合、内化作用的动态影响,评价了rhMBL调理后的病毒对人髓样单核细胞系THP-1吞噬功能、人单核细胞来源的巨噬细胞(MDMs)的细胞因子产生情况的影响。本研究获得以下主要结果：一、重组人甘露糖结合凝集素与病毒表面糖蛋白相互作用结果1.高病毒载量时,rhMBL对H7N9和H3N2流感病毒有较强的结合,对H9N2病毒的结合程度中等。2.rhMBL在高达3.67±0.33μg/mL可抑制H7N9病毒血凝活性,对2014年新出现的具有HA133糖基化位点的H7N9病毒(H7N9HA-A135S RG)血凝活性的抑制效应无明显改变,而抑制H3N2、H9N2病毒血凝活性的效应浓度可低到0.026±0.001μg/mL和0.083±0.02μg/mL.3.rhMBL在高达10μg/mL时仍不能抑制H7N9病毒的神经氨酸酶活性,但能明显抑制H3N2、H9N2病毒神经氨酸酶活性,最低效应浓度分别为0.0807±0.009μg/mL和0.0625μg/mL。4.rhMBL对H7N9病毒HA、NA功能活性的低效应可能同H7上N-糖基化位点(NGS)数目少、或HA头部仅有的糖基化位点(240位)距HA受体结合区(RBD)远、N9酶活功能区附近的关键糖基化位点(如NA234和402)缺失等结构相关。二、rhMBL对病毒感染特性和调理后的病毒对免疫细胞活化的影响结果1.在10μg/mL,rhMBL仍无法中和H7N9病毒的感染力,但能抑制H3N2和H9N2病毒的感染,最低效应浓度分别为0.053±0.02μg/mL和0.78±0.16pg/mL。2.在3μg/mL,rhMBL无法有效阻断高载量的H7N9病毒对易感靶细胞的一轮感染,但能阻断H3N2和H9N2病毒的一轮感染。3.在3μg/mL,rhMB L无法抑制荧光标记的H7N9和H3N2病毒的内化,可有效抑制荧光标记的H9N2病毒。4.3μg/mL的rhMBL促进了THP-1对H7N9、H9N2病毒的吞噬。5.H7N9病毒诱导MDMs分泌的TNF-α、RANTES、IP-10、MCP-1水平普遍高于H9N2病毒。rhMBL调理后的H7N9、H9N2病毒诱导MDMs分泌了更高水平的TNF-α、RANTES、IL-8。结论1.rhMBL可有效结合H7N9病毒,但在生理浓度范围内,对病毒的血凝活性和神经氨酸酶活性的抑制有限。rhMBL基本无法阻断H7N9病毒进入靶细胞,不能发挥中和效应。2.rhMBL对H3N2和H9N2病毒则可发挥很好的血凝活性和神经氨酸酶活性抑制,阻断病毒进入靶细胞,在低浓度时即可有效中和病毒感染；3.rhMBL促进了THP-1对H7N9、H9N2病毒的吞噬,二者诱导MDMs产生更高水平的TNF-α、RANTES、IL-8;4.MBL这种存在于人体固有免疫系统中的关键分子,其对本研究中的这三种病毒的感染特性及病毒感染的免疫细胞活化发挥不同效应。MBL无法抑制H7N9的感染,且可增强免疫细胞的吞噬和细胞因子应答可能同H7N9致病机制相关,部分解释了患者重症的临床表现。