论文部分内容阅读
猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)是一种严重影响全球养猪业的重要病原。非结构蛋白9(nsp9)是PRRSV的RNA依赖的RNA聚合酶(RdRp),参与形成病毒的复制与转录复合体(RTC),在病毒的复制调控和致病性方面具有重要的作用。迄今为止,PRRSVnsp9的生物学特性尚未完全阐明。本研究聚焦于分析PRRSVnsp9的组成、定位和与细胞内膜系统的关系及其潜在的复制非必需位点,以期为进一步阐明nsp9的功能提供科学依据。在PRRSV感染细胞中nsp9是否包含nsp8尚无定论。为了证实nsp8构成nsp9的N端,经表达和纯化nsp8融合蛋白(GST-nsp8),制备出兔源抗nsp8多克隆抗体(多抗),并利用nsp9和nsp10单克隆抗体(单抗)、nsp7和nsp9多抗,采用免疫沉淀技术鉴定nsp9的分子大小。结果显示,PRRSV感染细胞中的nsp9分子量介于72～95 kDa之间,且与体外表达的nsp8-90RF1b大小一致,但大于体外表达的nsp9ORF1b。同时,nsp8多抗分别能够检测并通过免疫沉淀结合与nsp9大小一致的条带,且经质谱分析其为包含nsp9ORF1b的肽段,而nsp7和nsp10抗体则不能。进一步通过体外切割试验证明nsp8-9ORF1b不能被PLP2和nsp4切割。以上结果表明PRRSVnsp8构成nsp9的N端部分。对nsp9在PRRSV感染细胞中的定位及与细胞内膜系统的关系进行了分析。应用Globplot分析了 nsp9的二级结构,并利用激光共聚焦鉴定出aa1-139、aa237-333和aa494-685是nsp9的膜结合区域,且后两者部分定位于线粒体。利用生物物理试验分离PRRSV感染MARC-145细胞的线粒体组分和细胞质组分。检测结果显示,nsp9主要分布于线粒体组分,且高盐和高pH值溶液均不能将其从线粒体中释放出来,表明nsp9紧密结合于线粒体膜结构。进一步研究发现其他RTC相关蛋白nsp2和nsp10也主要分布于线粒体组分。将线粒体组分分层,结果显示nsp9、nsp2和nsp10与线粒体蛋白处于相同的分层。然而,激光共聚焦观察结果显示,在PRRSV感染MARC-145细胞内,nsp9与线粒体无明显共定位。最后利用siRNA干扰技术证明线粒体外膜蛋白MFN2与PRRSV的复制和增殖有关。以上结果表明,以nsp9为核心的PRRSV RTC与线粒体膜有密切关系。分析了 PRRSV nsp9中复制非必需位点。对16个PRRSV 2(基因2型)代表性毒株nsp9氨基酸序列进行了同源性分析,结果表明不同毒株nsp9氨基酸同源性为94.9%～99.7%,仅PRRSV毒株HB-1/3.9的nsp9第109位甘氨酸(G109)缺失。利用感染性cDNA克隆技术,构建并拯救出分别以pWSK-HB-1/3.9和pWSK-JXwn为骨架的插入病毒RvHBn9+109G和缺失病毒RvJXn9AG109,测定拯救病毒在细胞上的增殖动态,分析了 nsp9 G109对PRRSV复制的影响。结果表明,RvHBn9+109G与RvHB-1/3.9在MARC-145细胞上的复制能力无明显差异;而RvJXn9AG109接种MARC-145细胞后,在12 hpi、24 hpi和36 hpi的病毒滴度分别是RvJXwn的36.67倍(p<0.001)、17.02倍(p<0.01)和8.38倍(p<0.5);接种猪肺泡巨噬细胞(PAMs)后,在12hpi和24hpi的病毒滴度分别是RvJXwn的17.52倍(p<0.001)和14.68倍(p<0.001)。而以pWSK-JXwn为骨架进一步构建的nsp9 G109两侧、N端和C端结构域连接处、C末端和N端氨基酸缺失的全长cDNA克隆质粒,并未拯救出病毒。以上结果表明,G109是PRRSVnsp9中的复制非必需位点,其缺失不影响PRRSV在细胞上的增殖。综上所述,我们的研究揭示了:(1)nsp8构成nsp9的N端;(2)在感染细胞中,nsp9与细胞线粒体膜有密切关系;(3)nsp9第109位甘氨酸是PRRSV复制非必需位点。研究结果为阐释PRRSVnsp9的生物学功能提供了重要的科学依据,也为深入研究nsp9调控PRRSV的复制和致病性的分子机制奠定了基础。