GPX4维持氧化还原稳态促进STING介导的天然免疫反应及机制

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研究背景肿瘤是严重影响人类健康的重大疾病,是环境与宿主因素相互作用的结果。宿主染色体DNA不稳定性是促进肿瘤发生和转移的重要因素。微生物感染与肿瘤发生密切相关,全世界约五分之一的人类肿瘤与慢性感染密切相关,其中EB病毒,乙型肝炎病毒,人乳头瘤病毒,卡波西肉瘤疱疹病毒和默克尔细胞多瘤病毒等DNA病毒与人类肿瘤存在明确的因果关系。DNA通常位于细胞核内,而异常定位于细胞质的DNA作为危险信号激活DNA识别受体环鸟苷酸-腺苷酸合成酶(cGAS),cGAS既可以识别进入宿主细胞的外源性病毒DNA,也可以识别由于肿瘤细胞染色体不稳定性或肿瘤放疗及化疗等诱因,泄漏至细胞质中的内源性细胞核或线粒体DNA,然后激活下游干扰素基因刺激因子(STING),STING募集TANK结合激酶1(TBK1)诱导干扰素和其他细胞因子生成并激活天然免疫反应。cGAS-STING信号通路被认为是具有巨大潜力的抗病毒和肿瘤免疫的治疗靶标,对于控制病毒感染和肿瘤发生至关重要。氧化还原反应是生命活动的基本动力和代谢机制,氧化还原稳态对维持生物体正常生理过程有重要意义。氧化还原紊乱与病毒感染和肿瘤等多种疾病的发生密切相关,脂质过氧化物生成失衡是氧化还原紊乱的重要表现。谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)作为重要的脂质过氧化氢酶,通过抑制脂质过氧化来维持细胞内氧化还原稳态。目前,细胞内氧化还原稳态对cGAS-STING信号通路介导的天然免疫反应的调控及其机制尚不清楚,GPX4在其中发挥的作用更不明晰。单纯疱疹病毒-1(HSV-1)属于DNA病毒,我们以HSV-1病毒感染细胞为模型进行研究,探讨DNA异常定位于细胞质时,细胞内氧化还原稳态调控cGAS-STING信号通路介导天然免疫反应及其机制。该研究旨在发现cGAS-STING信号通路活化的新机制,为精准防治病毒感染和肿瘤免疫治疗提供新策略。研究目的解析GPX4维持的氧化还原稳态促进cGAS-STING信号通路介导天然免疫反应的机制,为发现抗病毒和肿瘤免疫治疗的新靶标提供理论依据。方法和结果1.GPX4缺失或失活选择性抑制cGAS-STING信号通路的活化Real-time PCR和ELISA检测发现GPX4缺失或失活显著抑制DNA病毒和cGAS-STING信号通路激动剂诱导的干扰素β(Ifnb)、CXC趋化因子配体10(Cxcl10)mRNA表达和IFN-β生成。然而,对维甲酸诱导基因Ⅰ受体(RLR)和Toll样受体(TLR)等其他模式识别受体的配体诱导的Ifnb mRNA表达和IFN-β生成没有影响。这些数据表明,GPX4缺失或失活可选择性的抑制cGAS-STING信号通路,而对RLR和TLR等依赖的信号通路没有影响。2.脂质过氧化抑制cGAS诱导的信号通路活化使用MTT和LDH检测发现,GPX4缺失不影响小鼠巨噬细胞的细胞活性。real-time PCR结果显示亚铁离子和两种磷脂(磷脂酰胆碱和磷脂酰肌醇)可以抑制HSV-1病毒感染诱导的Ifnb mRNA表达。使用免疫印迹和real-time PCR的检测发现,脂质过氧化抑制剂可以阻断GPX4缺失或失活导致的HSV-1病毒感染后Ifnb mRNA表达降低和干扰素调节因子3(IRF3)磷酸化水平降低。以上结果表明,GPX4缺失或失活引起的脂质过氧化作用是cGAS-STING信号通路活化抑制的原因。3.GPX4缺失或失活促进细胞内过氧化脂质水平并抑制cGAS依赖的信号通路脂质过氧化是机体对应激反应的生理校正反应,脂质过氧化反应增强导致多种病理状态。4-HNE(4-羟基壬烯醛)和MDA(丙二醛)是脂质过氧化的两种主要终末产物,ELISA检测发现在病毒感染过程中其产量增加,且GPX4的缺失或失活进一步增加了细胞内脂质过氧化物的含量。ELISA和real-time PCR检测发现,4-HNE刺激显著抑制STING激活后下游Ifnb表达和生成。免疫印迹检测结果显示4-HNE抑制HSV-1感染诱导的下游分子磷酸化。这些数据表明,细胞脂质过氧化作用通过其最终产物,如4-HNE,特异性抑制cGAS-STING信号通路活化。4.GPX4是STING从内质网(ER)转位至高尔基体所必需的分子ChIP、ELISA、real-time PCR检测发现GPX4缺失或失活对HSV-1基因组DNA与cGAS的结合、cGAS酶活性或cGAMP活性没有影响。报告基因结果证实GPX4失活对IFN-β的调控作用靶向于STING。免疫荧光结果显示GPX4缺失或失活抑制STING从内质网(ER)转位至高尔基体。因此,GPX4维持的氧化还原稳态是STING从ER向高尔基体转位所必需的条件。5.GPX4通过抑制STING羰基化来促进STING活化免疫荧光检测证实4-HNE靶向STING并与其结合。使用液相色谱-质谱联用(LC-MS/MS)检测体外羰基化样品,确定了 STING可能发生羰基化修饰的位点。在体外和细胞内使用羰基化探针(m-APA)进行检测证实C88位为STING羰基化的必要残基,STING-C88A完全消除了 STING羰基化。这些结果表明,GPX4通过抑制STING羰基化维持STING正常活化。6.GPX4对于体内DNA病毒诱导天然免疫反应至关重要为了研究GPX4在体内病毒感染环境下的生理和病理相关性。使用GPX4抑制剂RSL3处理小鼠或GPX4敲除小鼠进行病毒感染体内实验,结果证实与对照组相比GPX4缺失或失活小鼠体内HSV-1感染诱导天然免疫反应显著低于对照小鼠,且病毒复制与组织损伤明显高于对照小鼠。这些数据表明,GPX4是cGAS-STING信号通路诱导IFN-β生成的关键调控分子。研究结论本研究证实谷胱甘肽过氧化物酶4(GPX4)维持的细胞氧化还原稳态是激活STING的必要条件。GPX4缺失增强了细胞脂质过氧化,从而特异性抑制cGAS-STING信号通路。机制方面,GPX4失活增加了脂质过氧化物的产生,导致STING的88位半胱氨酸被羰基化修饰,并抑制其从内质网向高尔基复合体的转运,由此特异性抑制了 STING介导的DNA识别通路。因此,本研究发现了 GPX4维持的氧化还原稳态促进STING介导天然免疫反应的新机制,为病毒感染和肿瘤等疾病防治提供了新的候选靶标。
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