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刚地弓形虫(Toxoplasma gondii)是世界上最常见的寄生虫之一,属于专性细胞内寄生的顶复门原生动物寄生虫,可寄生在人和各种脊椎动物当中。由于其感染人体可以造成怀孕妇女流产或死胎、胎儿畸形等疾病以及会使免疫缺陷患者产生脑炎、视网膜炎等,甚至潜在致命风险,使其备受关注。弓形虫棒状体蛋白(TgROPs)是弓形虫入侵和发挥毒力的关键因子,在虫体入侵宿主细胞与后续繁殖过程中有着重要作用,同时也是治疗和预防弓形虫病的药物作用靶点及疫苗候选组分。本研究利用分子生物学手段构建了刚地弓形虫ROP16和ROP18基因的复合基因真核表达重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18,并将其转染Hela细胞验证其在真核细胞中的表达。用该重组质粒对BALB/c小鼠进行免疫后,通过对小鼠的相关免疫性指标进行测定来评估其对动物的免疫保护效果。首先提取刚地弓形虫速殖子总RNA,根据弓形虫棒状体蛋白16(TgROP16)与棒状体蛋白18(TgROP 18)基因的开放阅读框架设计引物,采用逆转录PCR(RT-PCR)方法扩增ROP16和ROP18基因,将二者分别连入至真核表达载体pVAX1中,构建重组质粒pVAX1-ROP16和pVAX1-ROP18并转化至大肠埃希菌(E.coli)XL1-Blue中。提取出阳性菌落质粒后对其进行PCR、酶切及基因测序验证。结果显示,TgROP 16与TgROP 18基因的RT-PCR扩增产物与预期相符,经PCR及双酶切鉴定该重组质粒构建正确。测序显示获得的TgROP 16基因片段为2124bp,获得的TgROP 18基因片段为1665bp,与GenBank已收录的弓形虫ROP16基因、ROP18基因序列一致性分别为99.8%与100%。结果表明克隆弓形虫ROP16和ROP18基因成功。随后对载体pVAX1的多克隆位点进行改造,构建载体pVAXA和pVAXB,PCR扩增载体pVAXA中包含-PCMV-MCS-BGHpolyA-表达单元片段,并将其连入载体pVAXB中,组建成具有两个启动子的表达载体pVAXD。将质粒pVAX1-ROP16和pVAX1-ROP18中的目的基因ROP16、ROP18通过酶切连入载体pVAXD中,构建重组表达载体pVAXD-ROP16-ROP18,并对其构建成功与否进行PCR及双酶切验证。接下来用重组表达载体pVAXD-ROP16-ROP18转染并培养Hela细胞后利用RT-PCR法及间接免疫荧光法检测两个基因在真核细胞内的表达。结果证实重组表达载体pVAXD-ROP16-ROP18经PCR和双酶切验证构建正确,RT-PCR检测显示,实验组与对照组β-肌动蛋白基因扩增产物均与预期大小相符,实验组能够扩增出ROP16与ROP18基因,而对照组未扩增出二者基因。间接免疫荧光法检测显示,重组质粒pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18转染组细胞可见绿色荧光,空质粒及对照组无绿色荧光。表明成功构建了重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18,且实现了该质粒在真核细胞中表达ROP16与ROP18基因。最后采取碱裂解法制备重组表达载体,并将等量的重组质粒pVAXD-ROP16-ROP18、pVAXD-ROP16+pVAXD-ROP18、pVAXD-ROP16、pVAXD-ROP18、pVAXD与生理盐水通过肌肉注射的方式,以2周一次的间隔时间对BALB/c小鼠连续免疫3次。收集各组小鼠每次免疫前1日和末次免疫2周后的血清并测定当中的特异性抗弓形虫抗体水平及细胞因子含量;对末次免疫2周后各组小鼠进行速殖子腹腔注射攻击实验后评估各组的生存情况。结果显示,各重组表达载体免疫组小鼠均经诱导产生了特异性针对弓形虫的IgG抗体,且随免疫注射次数的增多IgG水平逐渐升高,其中复合基因疫苗组与混合基因疫苗组比其他组有更高的抗体水平、细胞因子水平和存活时间(p<0.05)。表明弓形虫ROP16-ROP18复合基因表达载体能够诱发产生较强的动物免疫应答,这为开发弓形虫复合基因疫苗的后续研究提供了实验基础。