研究背景与目的炎症性肠病(inflammatory bowel diseases, IBD)是一种慢性、复发性的肠道炎症性疾病,包括克罗恩病(Crohn’s disease, CD)和溃疡性结肠炎(ulcerativecolitis, UC),在世界范围内的发病率和致死率均呈逐年上升趋势,但它的确切病因及具体病理机制仍未清晰。氨基水杨酸类、糖皮质激素、免疫抑制剂以及生物制剂是目前临床上用于治疗IBD的主要药物,但是它们由于长期应用副作用大、仅对部分患者有效、疗效不稳定或价格昂贵等原因,在使用时受到一定的限制。因此,寻找新型IBD治疗药物意义重大。羧胺三唑(carboxyamidotriazole, CAI)是一种非细胞毒类抗癌药物,在体内外模型中均显示出抑制肿瘤细胞增殖及转移的作用,并且还可以抑制血管新生。此外,本课题组通过动物实验已证实,CAI在一系列急、慢性炎症模型及自身免疫性疾病模型中均显示出良好的抗炎效果。在这些模型中,CAI可以明显降低实验动物炎症部位和血清中促炎细胞因子的水平,而这些细胞因子过分表达对IBD的发病与病理改变具有重要影响,同时它们的表达受到NF-κB和NLRP3炎症体激活的双重影响。因此,我们建立了TNBS诱导的大鼠化学诱导性结肠炎模型,来探讨CAI对结肠炎的治疗效果和其是否是通过调控NF-κB和NLRP3炎症体激活而发挥作用。研究方法采用TNBS诱导的大鼠化学诱导性结肠炎模型,观察并测试大鼠体重、粪便和便血情况,从疾病活动指数(DAI)评分、宏观评分、病理组织学评分和各种炎症相关评价指标,如MPO活性及lipocalin-2水平等方面评价CAI的治疗效果。采用酶联免疫吸附法(ELISA)检测造模7天后大鼠结肠组织与血清内各种细胞因子含量,包括TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-10、IL-17A、IL-18和TGF-β的水平。采用RT-qPCR法检测mRNA水平上NLRP3、ASC和caspase-1的含量。采用Western blot法或免疫组织化学方法测定蛋白水平上NF-κB信号通路与NLRP3炎症体中各因子含量,包括NF-κB p65、IκBα与p-IκBα、NLRP3、ASC、pro-caspase-1与caspase-1、IL-1β与IL-18的前体和成熟体蛋白的表达。研究结果1.80mg/kg的TNBS-50%乙醇溶液可以成功诱导大鼠化学诱导性结肠炎,其肠道改变与CD的病理变化相似。模型大鼠表现为肠腔狭窄,肠壁增厚,黏膜充血、水肿、溃疡或肉芽肿形成,黏膜炎症细胞浸润(以中性粒细胞为主)、隐窝结构破坏和杯状细胞缺失等。2. CAI (10、20、40mg/kg)可以显著改善模型大鼠体重降低情况及DAI评分。CAI(20、40mg/kg)可以显著改善脾大、结肠长度缩短情况,降低动物宏观评分与组织学评分。CAI(40mg/kg)能够降低实验动物结肠重量的增加。3.整体观察时可见CAI (20、40mg/kg)组大鼠结肠充血、肠结节、肠壁增厚等症状显著缓解,黏膜破损范围较小；组织学观察时可见CAI(10、20、40mg/kg)组大鼠黏膜损害累及范围缩小,中性粒细胞浸润、杯状细胞缺失以及隐窝结构破坏程度明显减轻。4. 与正常对照组相比,溶剂对照组大鼠肠组织中的MPO活性及血清中的lipocalin-2水平等炎症相关指标明显上调(P<0.01),同时肠道通透性增加,血清中的FITC-dextran水平升高。经CAI治疗后,MPO活性、lipocalin-2和FITC-dextran水平均降低,肠道通透性明显下降。5.与正常对照组相比,TNBS诱导的大鼠结肠组织匀浆中的TNF-α、IL-1β、IL-6、 IL-10、IL-17A、IL-18和TGF-p水平和血清中的TGF-β水平均显著升高(P<0.01),经CAI治疗后降低,且具有统计学差异。6. Western Blot的检测结果显示,与正常对照组相比,TNBS诱导的大鼠结肠组织内IL-1β及IL-18前体及成熟体蛋白含量均升高(P<0.01),经CAI治疗后,pro-IL-1β、IL-1βp17、pro-IL-18和IL-18 p18四种蛋白的表达均明显降低。7. 免疫组化的检测结果显示,正常对照组大鼠结肠组织内NF-κB p65表达很少,多见于细胞胞浆内。经TNBS诱导后,NF-κB p65的阳性表达显著上调(P<0.01),并且多见于细胞核。经CAI治疗后,NF-κB p65阳性表达明显下调,细胞核与胞浆内的染色程度均降低。8. Western Blot的检测结果显示,与正常对照组相比,TNBS诱导的大鼠结肠组织内p-IκBα的水平明显上调,而IκBα的水平明显降低(均P<0.01)。CAI能够显著抑制TNBS引起的大鼠结肠组织内IκBα降解及p-IκBα水平的上调。9. RT-qPCR的检测结果显示,与正常对照组相比,TNBS诱导的大鼠结肠组织内NLRP3和caspase-1的mRNA水平显著上调(均P<0.01),经CAI治疗后明显降低,而ASC的mRNA水平在各组间未发生明显改变。10. Western Blot和免疫组织化学的检测结果均显示,与正常对照组相比,TNBS诱导的大鼠结肠组织内NLRP3和caspase-1的蛋白含量明显升高(均P<0.01),经CAI治疗后降低,而ASC的蛋白表达水平在各组间未发生明显改变。结论CAI对TNBS诱导的大鼠结肠炎有较好的治疗效果。整体水平与组织细胞水平的研究显示,CAI可以改善模型大鼠疾病严重程度,抑制肠黏膜炎性反应,保护和维持肠道的完整性,在临床症状和病理改变方面抑制并缓解结肠炎的发展。我们认为,CAI的治疗作用与其较强的抗炎能力有关。CAI能够抑制促炎细胞因子产生,如降低组织中升高的TNF-α、IL-1β、IL、IL-17A以及IL-18的含量。CAI对组织和血清中TGF-β的表达水平也有下调作用,提示CAI可能有抗纤维化的作用,可以减缓结肠组织中胶原纤维的沉积。同时,CAI能够抑制NF-κB信号通路以及NLRP3炎症体激活,从而减轻肠道炎性损害,改善多种炎症症状。综上所述,我们可以推测,CAI可作为一种口服治疗IBD的潜在的候选药物。