视网膜水肿是许多眼部疾病导致视功能受损的重要原因,如视网膜中央静脉阻塞,葡萄膜炎以及糖尿病视网膜病变。特别是糖尿病黄斑水肿(DME)是导致糖尿病病人视力丧失的最常见原因之一。Wisconsin糖尿病视网膜病变研究组研究发现在Ⅰ型糖尿病病程超过14年的患者中,糖尿病黄斑水肿发生率超过26%[1]。视网膜水肿时积聚的液体压迫视网膜神经元,神经纤维从而导致神经变性,坏死,而水肿时液体对视网膜血管的压迫则会减少视网膜的血供从而加重视网膜缺血的情况,同时,由于液体的积聚也导致视网膜代谢所需的氧和代谢所需底物弥散距离延长,所有这些都会导致视力下降,视功能受损[2].视网膜间隙内积聚的液体既可能由于血视网膜屏障(BRB)受损,液体由血管内渗漏到视网膜间隙中所致,也可能是由于视网膜液体清除机制受损,不能及时有效地把液体从视网膜组织中移除到血管中所致[3,4]。正常情况下,液体进人视网膜组织和液体从视网膜中被清除的速度保持着动态平衡,一旦这种平衡被破坏,液体不能及时从视网膜组织中清除,视网膜水肿就会形成。既往的研究表明,有临床意义的糖尿病黄斑水肿除了有视网膜血管渗漏的因素外,还要有血视网膜屏障的主动转运机制的破坏才会发生[5]。另一项研究也发现,视网膜水肿的产生仅仅有血管渗透性异常是不够的,还需要伴有视网膜水肿清除机制的不足[6]。在血管照影检查中没有发现视网膜血管渗漏的病人中,其黄斑水肿发生的重要原因就是液体从视网膜实质吸收清除的机制受损,由此,视网膜实质液体吸收清除机制的功能不足或受损应被认为是视网膜水肿形成的一个重要病理机制[2]。在正常和健康情况下,视网膜胶质细胞如Muller细胞保持内层视网膜持续处于脱水状态,以避免出现视网膜水肿,而视网膜下间隙和外层视网膜则由色素上皮细胞(RPE)的泵的功能发挥作用,排除液体,从而保证其处于干燥状态[3]。Muller细胞是脊椎动物视网膜上最主要的胶质细胞,贯穿整个视网膜,由于在解剖上与视网膜神经元,视网膜血管和玻璃体密切相连[7,8],Muller细胞在维持和调节血视网膜屏障功能上发挥重要作用[9]。研究表明Muller细胞上有两种蛋白表达：水通道蛋白4(AQP4)和内向整流性钾通道4.1(Kir4.1),这两种蛋白主要表达在Muller细胞环绕视网膜血管的细胞膜上,正是通过这两种蛋白的帮助,Muller细胞介导了跨细胞水的转运从而发挥其调节视网膜水稳态平衡的重要作用[10]。水通道蛋白是跨细胞膜水通道蛋白。水通道蛋白1(AQP1),水通道蛋白4(AQP4)和水通道蛋白9(AQP9)已经在大脑中被确认,但是目前发现水通道蛋白4在脑水肿的病理生理机制中发挥重要作用,因而正日益受到研究者的重视[11]。在诸如缺血,外伤,脑肿瘤和多发性硬化等许多人类神经病理情况下,水通道蛋白4的表达都有升高[12,13]。我们以前的研究也发现,大鼠暴露于缺氧环境后,其视网膜上水通道蛋白4的蛋白和mRNA的表达也明显增加[14]。Kir4.1通道蛋白主要位于Muller细胞环绕视网膜血管的突起以及视网膜的内、外界膜上[15-17].可以看出,Kir4.1和AQP4共同表达于Muller细胞的特殊膜区域,它们的这种表达方式使得人们猜想Muller细胞转运水的方式是与其介导的K+空间缓冲相伴随[10]。Muller细胞介导的从视网膜组织中吸收排除液体机制主要依赖于通道介导的钾离子和水的共转运,任何钾离子通道的功能失调应该会导致视网膜液体清除障碍,因此将会导致视网膜水肿的形成[2]。糖尿病视网膜病变现在被认为是一种炎症性病变。在糖尿病早期,活化的小胶质细胞以及许多炎症因子参与到糖尿病视网膜病变的病理过程中。很有可视网膜组织AQP4和Kir4.1的表达与这些炎症因子也有关系,因为最近的研究发现,血管内皮生长因子(VEGF)和白介素1-β(IL-1β)参与到AQP4的表达[18],炎症因子也改变了培养的星状胶质细胞的钾离子电流[19]。米诺环素是第二代半合成四环素类药物,具有抗炎效果,而且其抗炎作用与它的抗菌作用完全无关。在许多实验中,米诺环素一直被用作小胶质细胞的抑制剂[20-23]。近年来的多项研究表明,米诺环素具有减少炎症介质表达、拮抗神经元凋亡,延缓老年性痴呆、亨廷顿病等神经变性疾病的动物及细胞模型病变进展,对于局灶性脑缺血神经元具有保护作用。米诺环素对减轻视网膜水肿是否有作用尚未见报道,因此本实验我们以糖尿病动物模型为对象,研究早期糖尿病大鼠视网膜水肿形成机制以及米诺环素环素对糖尿病视网膜水肿的影响。第一部分早期糖尿病大鼠视网膜AQP4, Kir4.1、VEGF, Occludin的表达改变第一节糖尿病动物模型的建立和大鼠视网膜AQP4. Kir4.1的表达改变目的：探讨早期糖尿病大鼠视网膜AQP4、Kir4.1的表达改变。方法：链脉佐菌素(streptozocin, STZ)诱导糖尿病Sprague-Dawley(SD)大鼠模型,采用免疫组化法、Western蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检测不同时间(造模成功后1周、2周和4周)大鼠视网膜水通道蛋白4(Aquaporin4,AQP4,内向整流性钾通道4.1(Kir4.1)的表达变化。结果：实验结果显示,糖尿病大鼠1、2周组视网膜AQP、Kir4.1 mRNA和蛋白的表达与对照组相比无明显改变；糖尿病4周组大鼠视网膜AQP4 mRNA和蛋白的表达与对照组相比明显上调；糖尿病4周组大鼠视网膜Kir4.1 mRNA和蛋白的表达与对照组相比明显下调。结论：早期糖尿病大鼠视网膜AQP4、Kir4.1的表达有差异,在糖尿病4周时,AQP4表达上调,Kir4.1的表达下调。第二节早期糖尿病大鼠视网膜VEGF, Occludin的表达变化情况及血视网膜屏障渗漏检测目的：探讨早期糖尿病大鼠视网膜VEGF、Occludin的表达改变。方法：链脉佐菌素(streptozocin, STZ)诱导糖尿病Sprague-Dawley(SD)大鼠模型,采用免疫组化法、Western蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检测不同时间(造模成功后1周、2周和4周)大鼠视网膜血管内皮生长因子(vascular endothelial growth facto, VEGF)和血管内皮细胞紧密连接蛋白(occludin)表达变化情况。异硫氰酸罗丹明(RHIC)检测血视网膜屏障渗漏情况。结果：糖尿病1周,2周,4周时大鼠视网膜VEGFmRNA和蛋白的表达与对照组相比均明显增加,而且随着时间的延长其表达逐渐升高,其差异有统计学意义(P<0.05)：糖尿病1周,2周,4周时大鼠视网膜Occludin mRNA和蛋白的表达与对照组相比均明显降低,而且随着时间的延长其表达逐渐下降,其差异有统计学意义(P<0.05)；在糖尿病1周,2周,4周大鼠视网膜都有RHIC渗漏,渗漏位于内界膜到外网层,外网层RHIC渗漏最显著。结论：早期糖尿病大鼠视网膜VEGF表达升高,Occludin的表达降低,随着糖尿病时间延长,VEGF表达逐渐升高,Occludin表达逐渐降低。早期糖尿病大鼠视网膜血视网膜内屏障有破坏。第二部分米诺环素对视网膜水肿影响的研究第一节：米诺环素对早期糖尿病大鼠视网膜VEGF、Occludin的表达的影响及血视网膜屏障渗漏检测目的：探讨米诺环素对早期糖尿病大鼠视网膜VEGF、Occludin表达的影响。方法：SD大鼠随机分为正常对照组；糖尿病4周组：一次性腹腔注射60mg/Kg STZ制造糖尿病模型；糖尿病4周+米诺环素干预组：糖尿病造模成功后腹腔注射米诺环素；米诺环素对照组：正常大鼠腹腔注射米诺环素；米诺环素连续注射4周后,采用免疫组化法、VVestern蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检测视网膜VEGF、Occludin的表达变化。异硫氰酸罗丹明(RHIC)检测血视网膜屏障渗漏情况。结果：与正常对照组相比,糖尿病4周组和糖尿病+米诺环素干预组大鼠视网膜VEGF mRNA和蛋白表达均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与正常对照组相比,糖尿病4周组和糖尿病+米诺环素干预组大鼠视网膜Occludin mRNA和蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与糖尿病4周组相比,VEGF mRNA和蛋白在糖尿病+米诺环素干预组大鼠视网膜中表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)；与糖尿病4周组相比,Occludin mRNA和蛋白在糖尿病+米诺环素干预组大鼠视网膜中表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,米诺环素对照组中大鼠视网膜VEGF、Occludin表达无明显变化(P>0.05)结论：米诺环素可以下调早期糖尿病大鼠视网膜VEGF的表达,抑制早期糖尿病大鼠视网膜Occludin的下调。米诺环素对正常大鼠视网膜VEGF和Occludin表达无影响。第二节：米诺环素对早期糖尿病大鼠视网膜AQP4、Kir4.1、Iba-1,1L-1β的表达的影响目的：探讨米诺环素对早期糖尿病大鼠视网膜AQP4、Kir4.1、Iba-1,IL-1β的表达影响。方法：SD大鼠随机分为正常对照组；糖尿病4周组：一次性腹腔注射60mg/Kg STZ制造糖尿病模型；糖尿病4周+米诺环素干预组：糖尿病造模成功后腹腔注射米诺环素；米诺环素对照组：正常大鼠腹腔注射米诺环素；米诺环素连续注射4周后,采用免疫组化法、VVestern蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检测视网膜AQP4、Kir4.1的表达变化。VWestern蛋白印迹法和Realtime-RT-PCR法检测视网膜Iba-1,IL-1β的表达情况。结果：与正常对照组相比,糖尿病4周组和糖尿病4周+米诺环素干预组大鼠视网膜AQP4、Iba-1, IL-1βmRNA和蛋白表达均明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)；与正常对照组相比,糖尿病4周组和糖尿病+米诺环素干预组大鼠视网膜Kir4.1mRNA和蛋白表达均明显降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与糖尿病4周组相比,AQP4、Iba-1, IL-1βmRNA和蛋白在糖尿病4周+米诺环素干预组大鼠视网膜中表达明显下降,差异有统计学意义(P<0.05)；与糖尿病4周组相比,Kir4.1mRNA和蛋白在糖尿病+米诺环素干预组大鼠视网膜中表达明显增加,差异有统计学意义(P<0.05)。与正常对照组相比,米诺环素对照组中大鼠视网膜AQP4、Iba-1, IL-1β, Kir4.1mRNA和蛋白表达无明显变化(P>0.05)结论：米诺环素可以抑制早期糖尿病大鼠视网膜AQP4、Iba-1, IL-1β的表达,抑制早期糖尿病大鼠视网膜Kir4.1的下调。米诺环素对正常大鼠视网膜AQP4Iba-1, IL-1β, Kir4.1表达无影响。