目的凋亡调控失衡与肿瘤的发生和发展密切相关，诱导肿瘤细胞凋亡已成为肿瘤药物治疗的主要目的与手段。凋亡有两条途径，一条为线粒体途径，另一条为死亡受体途径，多种抗肿瘤药物、射线、活性氧等均通过线粒体途径引起细胞凋亡，在深入研究凋亡调控机制与信号转导途径的过程中，线粒体在细胞凋亡中的作用日益受到人们的关注。研究表明，过表达Bcl-2能够抑制细胞的凋亡而促进细胞生长。Bcl-2家族是哺乳动物细胞中调节凋亡的重要因子，通过调节线粒体或内质网等细胞内膜结构的通透性，线粒体的通透性改变（permeability transition，PT）是调节凋亡的中心环节，改变与细胞生理功能密切相关的离子或蛋白质因子在细胞内的分布，从而影响细胞的生命活动过程。在凋亡的线粒体途径中，各种凋亡促发因素通过调节线粒体外膜的通透性，释放线粒体膜间隙的促凋亡蛋白质因子如细胞色素C（cytochrome-C）和Smac／DIABLO等进入细胞浆，通过依赖caspase的途径激活细胞凋亡或者释放凋亡诱导因子（apoptosis inducing factor，IF）等通过不依赖caspase的途径引起细胞凋亡。Bcl-2家族中抑制细胞凋亡与促进细胞凋亡蛋白之间的平衡，对其在改变线粒体通透性、调节线粒体蛋白释放起着决定作用，但具体机制还存在许多争论。对细胞凋亡过程起调节作用的除了非常熟悉的Bcl-2家族外，尚有另外一个家族就是细胞凋亡抑制蛋白（IAPs）家族，凋亡蛋白抑制子（IAP）家族中生存素（Survivin）、X联锁凋亡蛋白抑制子（XIAP）过表达，抑制促凋亡因子对caspase激活及对细胞增殖的影响导致肿瘤细胞对凋亡刺激的抵抗。凋亡与坏死是在形态学上不同的两种细胞死亡形式，凋亡细胞核碎裂形成凋亡小体，细胞膜完整。坏死特点是细胞肿胀，细胞内细胞器裂解，细胞膜不完整。凋亡细胞被巨噬细胞吞噬，坏死细胞则释放细胞内容物引起炎症及组织损害。细胞凋亡的机制研究的非常广泛，而细胞坏死研究较少。砷剂的抗肿瘤机制主要通过线粒体途径引起细胞凋亡来实现，同时也有引起细胞坏死及自溶，砷剂与巯基结合后，导致MPT开放，线粒体跨膜电位（△ψm）下降或消失，继之呼吸链脱偶联，谷胱甘肽耗竭，活性氧类（reactive oxygen species，ROS）产生及对诱导凋亡非常重要的蛋白酶活化物的释放，包括细胞色素C（Cyto-C）和凋亡诱导因子（AIF），Cyto-C和AIF均可激活caspase诱导凋亡。Bcl-2的过度表达可抑制砷剂诱导的凋亡相关现象，而通过反义技术使Bcl-2下调可抑制细胞增殖及促进凋亡。砷剂可通过对Bcl-2基因功能的抑制诱导某些肿瘤细胞的凋亡，三氧化二砷（As₂O₃）对肿瘤细胞的杀伤过程中在不同细胞背景下，对Bcl-2、活性氧及凋亡抑制蛋白家族的影响不同。As₂O₃对胃癌细胞的杀伤机制研究很少，具体机制仍不清。本研究以胃癌细胞系MGC803、BCG823、SGC7901为模型，研究As₂O₃对胃癌细胞杀伤过程中线粒体途径相关的活性氧、Bcl-2家族及凋亡抑制蛋白家族中的Survivin在此过程中的作用及在凋亡与坏死两种不同杀伤机制中的差异，进一步明确As₂O₃对胃癌细胞杀伤机制，为在临床中更好应用奠定基础。材料与方法1．采用MTT法测定细胞活力，绘制增殖曲线。2．采用瑞氏-姬姆萨染色，光学显微镜下观察As₂O₃诱导MGC803细胞死亡时的形态学变化。3．采用流式细胞仪通过PI染色进行细胞周期解析及凋亡判定。4．采用western blot检测Bcl-2、Survivin及caspase-3蛋白的表达。5．采用DiOC 6（3）单染法检测线粒体跨膜电位（△ψm）的变化。采用罗丹明和碘化丙啶双染法检测线粒体跨膜电位（△ψm）改变与细胞存活状态的关系。应用流式细胞仪通过2′，7′-二氯乙酰乙酸盐荧光素标记检测细胞内活性氧水平。6．统计学处理所有数据用3次独立实验的平均值表示，采用学生t检验。实验结果1．As₂O₃呈时间、浓度依赖性抑制胃癌MGC803、BCG823、SGC7901细胞的增殖，72h抑制细胞增殖50％的药物浓度(IC₅₀)分别为2.8、3.1、10.2uM，MGC803、BCG823、SGC7901细胞的活性氧水平在未用药时活性氧峰值水平分别为20、64.3、57.6，5uM As₂O₃作用24h后三种细胞系活性氧峰值水平分别为100.8、103.3、56.5，在应用5uM的As₂O₃作用24h后，MGC803、BCG823细胞的活性氧水平明显增高，而SGC7901细胞只有少数细胞活性氧增高。2uM及5uM的As₂O₃均引起细胞内的活性氧明显升高，峰荧光强度分别由对照的20升高到为80、70，而25uM的As₂O₃没有引起明显的升高。5uM的As₂O₃作用36h，细胞内活性氧3h开始增高，12h达到高峰值。2、5、25uM As₂O₃作用12及24h后线粒体跨膜电位出现降低，24h的线粒体跨膜电位降低的细胞数分别为8.2％、16.1％、23％，能够呈时间及浓度依赖性降低线粒体跨膜电位。2．氮乙酰半胱氨酸（NAC）能够明显抑制As₂O₃对MGC803细胞的杀伤作用，联合应用As₂O₃ 48h的IC₅₀浓度大于25uM，单独应用时的IC₅₀约为5uM。10mM的NAC与5uM As₂O₃同时应用12h，NAC明显降低细胞内的活性氧水平，对照组为12.4，单独应用As₂O₃组为30.5，而联合应用组为7.2。48h流式细胞仪检测细胞周期，单独应用As₂O₃组亚G₀／G₁期细胞为29.32％，G₂／M期细胞为38.19％，出现了亚二倍体峰及G₂／M期阻滞，联合应用组未见亚二倍体峰及G₂／M期阻滞，细胞周期接近正常对照。3.5μM As₂O₃作用24h细胞形态学可见细胞核浓聚，染色质非正常分裂及凋亡小体，有明显的M期阻滞。25、50μM As₂O₃作用24h细胞可见明显的核固缩，胞浆空泡变性，未见G₂／M期阻滞。5μM As₂O₃作用24h后细胞出现凋亡细胞由对照的1.2％增加到32.8％。坏死细胞增加到12％。而25μM的As₂O₃作用24h后坏死细胞由5.9％增加到72.2％。而凋亡细胞由对照的1.2％增加到8.1％，结果显示25μM的As₂O₃作用后主要以细胞坏死为主。2、5、25、50uM As₂O₃作用24h，各浓度As₂O₃均能引起线粒体Cyto-C向细胞浆中释放，线粒体内Cyto-C明显减少。4.5uM的As₂O₃作用MGC803细胞24h，早期凋亡细胞数由1.44增至20.37，坏死细胞由5.7％增加到14.36％，而10uM的BSO与5uM的As₂O₃联合应用组，凋亡细胞由单用As₂O₃的20.37％降至7.44％，坏死细胞由14.36％增加到46.11％。结果提示BSO通过诱导肿瘤细胞坏死而不是凋亡来增加As₂O₃对MGC803细胞的杀伤作用。5uM的ms₂O₃作用24h可激活Procaspase-3后出现17及12KD的活性亚基，10uM的BSO与5uM的As₂O₃联合作用后，Procaspase-3只出现17KD的活性亚基，且表达水平为单用As₂O₃的50％。10mM NAC与BSO同时与5uM的As₂O₃共同作用24h，Caspase-3的表达与对照组没有区别。5.5μM As₂O₃作用MGC803细胞12-48h均诱导Bcl-2蛋白出现磷酸化，12h可出现，36h Bcl-2蛋白磷酸化达到峰值，48h减弱，25μM的As₂O₃作用24h未见Bcl-2蛋白出现磷酸化，Bcl-2蛋白无明显变化。5μM As₂O₃作用MGC803细胞48h，从24h起可见Caspase-3剪切活化形式17、12 KD的小片段，一直持续到48h，Procaspase-3无明显变化。25μM As₂O₃作用MGC803细胞48h，从24h起下调Procaspase-3，48h接近消失，但未见到活化后形成的小片段。6.5μM As₂O₃作用MGC803细胞6-36h，结果显示活性氧在贴壁与非贴壁细胞中无明显差别。6h后未贴壁细胞均出现线粒体跨膜电位（△ψm）降低，24h最明显，约55％的细胞线粒体跨膜电位（△ψm）明显降低。而贴壁细胞中未见细胞线粒体跨膜电位（△ψm）的下降。5μM As₂O₃作用24h后分离贴壁与非贴壁细胞，检测Bcl-2、Survivin及Caspase-3蛋白表达，24h非贴壁细胞Bcl-2蛋白出现磷酸化，Survivin表达明显增高，Caspase-3蛋白被活化，该部分细胞为凋亡及G₂／M期细胞，两部分细胞比例接近，而贴壁细胞为G₀／G₁、S及G₂期细胞，Bcl-2蛋白磷酸化水平低于As₂O₃作用24h的水平，Survivin表达接近对照细胞，Caspase-3蛋白未见明显活化。贴壁与非贴壁细胞去除药物后继续培养12、24h，贴壁细胞Bcl-2、Survivin、Caspase-3蛋白表达未见明显变化，非贴壁细胞Bcl-2蛋白磷酸化减弱，Survivin表达在继续培养12h时略降低，24h后明显降低，降至24h分离时的30％。7.500nM Okadaic acid及100nM Staurosporine与G₂／M期细胞作用4h，Okadaicacid能够保持Bcl-2蛋白磷酸化，Staurosporine能够使Bcl-2蛋白脱磷酸化。流式细胞仪检测结果Okadaic acid作用2h、4h时亚二倍体细胞分别为19.51％、40.8％，Staurosporine作用2h、4h时亚二倍体细胞分别为10.61％、11.2％，4h对照细胞的亚二倍体细胞数为15.27％。8.5uM的As₂O₃从12h起明显上调Survivin蛋白表达，36h达到峰值，上调到对照的2.5倍，48h下降，蛋白表达水平为对照的1.4倍。25 uM的As₂O₃作用72h下调Survivin蛋白表达。Ly294002与As₂O₃共同作用3-24h，各时间点均能抑制As₂O₃对Survivin表达的上调。不同浓度的Ly294002作用12h，呈浓度依赖性抑制As₂O₃对Survivin表达的上调，而对细胞内在的Survivin表达没有影响。且能在24h时增强Bcl-2蛋白磷酸化。25uM Ly294002在24、48h均能增强5uM As₂O₃诱导MGC803细胞凋亡及G₂／M阻滞，As₂O₃单独及联合应用Ly294002 24h的亚二倍体细胞数为8.2％、14.8％，G₂／M期细胞分别为32.38％、56.4％，48h亚二倍体细胞数为15.9％、26.7％，G₂／M期细胞分别为26.72％、42.5％。讨论凋亡是机体为维持内环境稳定由基因控制的细胞自主的程序性死亡，与组织器官的发育、机体正常生理活动的维持、衰老及疾病的发生等过程密切相关，对于维持多细胞机体的完整性和自身稳态具有重要意义。线粒体在细胞凋亡的过程中起着重要作用。As₂O₃对早幼粒细胞白血病具有较好的疗效，同时对多种白血病及实体瘤细胞均有杀伤作用，主要机制为诱导肿瘤细胞凋亡。近年来研究表明，不同的凋亡刺激通过活性氧的产生及线粒体跨膜电位的下降引起线粒体膜通透性的改变，导致细胞色素C的释放及Caspase的活化，而引起凋亡的因素如神经酰胺、肿瘤坏死因子、紫外线、蒽环类抗肿瘤药等被证实通过活性氧产生引起凋亡，As₂O₃作为新的凋亡诱导剂主要通过活性氧的产生，尤其是过氧化氢（H2O2），诱导肿瘤细胞凋亡，也有文献报道肿瘤细胞对As₂O₃的敏感性与细胞内在固有活性氧水平有关。Bcl-2蛋白家族在线粒体凋亡途径中发挥重要作用，As₂O₃通过下调Bcl-2蛋白表达、诱导自身或相互间形成二聚体、Bcl-2磷酸化、蛋白水解及线粒体膜转位等方式，参与PTP的形成、开放及MPT的调节，研究发现Bcl-2蛋白能够抑制脂质过氧化引起的细胞凋亡，Bcl-2蛋白参与As₂O₃对肿瘤细胞的杀伤。As₂O₃对肿瘤细胞的杀伤与活性氧、线粒体跨膜电位及与凋亡蛋白之间的关系仍有争议，本研究结果显示As₂O₃对三种胃癌细胞系均有杀伤作用，但对As₂O₃的敏感性不同，在细胞内在活性氧上反映不出敏感性差异，而与As₂O₃作用后活性氧的升高水平有关，结果显示，应用NAC能够明显抑制As₂O₃对肿瘤细胞的杀伤作用，NAC能够抑制细胞内活性氧的产生及As₂O₃诱导胃癌MGC803细胞的G₂／M期阻滞和凋亡，由此可见As₂O₃诱导胃癌MGC803细胞的G₂／M期阻滞和凋亡需要活性氧的参与。但在5μM As₂O₃作用6-36h的不同时间点，结果显示活性氧在贴壁与非贴壁细胞中无明显差别。As₂O₃诱导胃癌MGC803细胞的凋亡需要活性氧的产生，活性氧的产生对于低浓度As₂O₃诱导胃癌MGC803细胞凋亡是必需但不是充分条件，还有另外机制参与。25μM的As₂O₃作用后主要以细胞膜完整性破坏为表现的细胞坏死为主。我们的结果显示，高浓度As₂O₃引起细胞坏死为主，不引起细胞周期阻滞及凋亡，低浓度As₂O₃引起细胞周期阻滞及细胞凋亡为主，同时伴有少数细胞坏死。BSO通过不依赖Caspase-3的细胞坏死途径来增强As₂O₃对MGC803细胞的杀伤。As₂O₃诱导MGC803细胞G₂／M期阻滞和凋亡过程中出现Bcl-2磷酸化而未见下调，通过对Bcl-2磷酸化的调节证明Bcl-2磷酸化促进As₂O₃诱导MGC803凋亡。Survivin表达的上调作为肿瘤细胞通过G₂／M检测点的促进因素，使细胞对As₂O₃诱导的凋亡产生抵抗，使肿瘤细胞耐药，Ly294002抑制As₂O₃对胃癌细胞Survivin表达的上调。As₂O₃对肿瘤细胞的杀伤需要活性氧的参与，但单纯的活性氧增高不能引起细胞凋亡，还需要其他因素共同参与，低浓度As₂O₃选择性诱导胃癌MGC803细胞G₂／M期阻滞及凋亡与Bcl-2蛋白磷酸化丧失其抗凋亡作用有关。Survivin表达的上调为肿瘤细胞获得性耐药增加对化疗的抵抗，下调survivin蛋白的表达增加As₂O₃的敏感性，提示survivin基因有望成为肿瘤治疗的理想靶标。结论As₂O₃对胃癌细胞的杀伤需要活性氧的参与，肿瘤细胞对As₂O₃的敏感性与As₂O₃作用后活性氧的升高相关。线粒体途径是As₂O₃诱导凋亡与坏死的共同通路，BSO增强低浓度As₂O₃对胃癌细胞的杀伤是通过改As₂O₃对胃癌细胞的杀伤模式，由凋亡转变为坏死来完成。G₂／M期肿瘤细胞对As₂O₃更敏感可能与G₂／M期细胞Bcl-2蛋白磷酸化，使其丧失其抗凋亡作用有关。As₂O₃作用后Survivin表达的上调为肿瘤细胞获得性耐药，Survivin表达的上调抵抗As₂O₃诱导的肿瘤细胞凋亡，下调survivin蛋白的表达增加As₂O₃的敏感性。