目的:卵巢上皮性癌(epithelial ovarian cancer, EOC,以下简称为卵巢癌)是导致妇女癌性死亡的主要原因。其特点为缺乏早期症状、就诊晚及生存率低。经肿瘤细胞减灭术及以铂类为主的化疗可产生初始疗效,但70%的晚期患者可因化疗耐药而导致治疗失败。寻求新的诊断和预后的生物学指标,并探讨化疗耐药相关机制将有助于指导卵巢癌临床治疗。胰岛素样生长因子(Insulin-like growth factor ,包括IGF-I和IGF-II )可促进细胞增殖并抑制凋亡,在恶性肿瘤的发生和发展中起着重要的作用。研究发现IGF-II蛋白酶解转化过程与IGF-II的生物学功能密切相关,IGF-II前体多肽(proIGF-II,156个氨基酸)可经修饰转化为两个大的IGF-II肽(big IGF-II,分别含有87、104个氨基酸)和成熟IGF-II(mIGF-II,67个氨基酸)。在某些病理状况下,IGF-II各肽比例发生改变,提示不同IGF-II肽可能具有不同的生物学活性。IGFs作用受其6个结合蛋白(Insulin-like growth factor-binding protein , IGFBP1～6)调节。IGF-I以及不同IGF-II肽与IGFBPs的结合活性以及相关生物功能各不相同。在所有IGF结合蛋白中,IGFBP-3在血浆中的浓度最高,其次为IGFBP-2。IGFBP-3是一种潜在的抗细胞增生蛋白,可以抑制肿瘤细胞增生,并诱导癌细胞凋亡。血浆IGFBP-3水平的降低与多种恶性肿瘤有关。IGFBP-3抗细胞增生的作用主要是可以和IGF-I以及IGF-II形成复合物,进而阻止它们激活IGF-I受体以及由此诱导的细胞增生,另外,IGFBP-3也可以通过不依赖于IGF的机制而起作用。IGFBP-2在许多恶性肿瘤中的表达都明显升高,且与肿瘤的生长和侵袭性有关。IGFBP-2水平升高亦可增加卵巢癌细胞的生长和侵袭性。体外研究表明卵巢上皮性癌细胞株可表达所有与IGF家族有关的因子。尽管IGF家族各因子在卵巢癌的发生、发展以及预后中分别起到一定的作用,但血循环中主要IGFBPs对IGF-II生物学功能的调节作用以及对卵巢癌细胞生物学行为的影响和化疗耐药性的相关性尚不清楚。本研究应用新近改良的Western Ligand Blot (WLB)以及Wertern Blot (WB)方法检测卵巢良性、交界性和恶性肿瘤患者微量血清(0.5μl)中IGF-II各肽和其主要结合蛋白IGFBP-2, IGFBP-3的含量以及相关性,探讨血循环中IGFBP-2, IGFBP-3改变对IGF-II生物学功能的调节作用,以及血循环与癌组织中IGFBP-2和IGFBP-3表达的相关性和相应的临床病理学特征,同时,应用敏感和耐药的卵巢上皮性癌细胞株研究IGFBP-3在卵巢癌化疗耐药中的作用以及相应机制,从而为探讨IGF-II以及IGFBP-2,IGFBP-3作为卵巢上皮性癌诊断、病情监测和疗效评价的生物学标记物提供依据。本研究分为四部分第一部分卵巢肿瘤患者IGF-II以及IGFBP-2和IGFBP -3的检测及临床意义目的:检测IGF-II (pro-, big-,mIGF-II), IGFBP-2及IGFBP-3在卵巢良性、恶性肿瘤患者血清中的含量,探讨其与卵巢肿瘤的鉴别诊断和临床病理学特征的相关性,研究是否联合检测IGF-II及其相应结合蛋白IGFBP-2,IGFBP-3可作为卵巢癌诊断和治疗监测的指标之一。方法:抽提滴加于滤纸上的微量血清,并采用Western Ligand Blot (WLB)和Wertern Blot (WB)方法分别检测23例卵巢上皮性癌(浆液性囊腺癌15例,粘液性囊腺癌8例),7例交界性肿瘤,20例卵巢良性上皮性肿瘤(其中浆液性囊腺瘤11例,粘液性囊腺瘤9例),22例妇科其他良性疾病患者以及21例妇科其他恶性肿瘤患者微量血清(0.5μl)中IGF-II各不同肽, IGFBP-2及IGFBP-3含量,同时以20例相应年龄健康妇女血清做正常对照。另外,分别对其中8例卵巢癌患者进行术前、术后以及化疗1个疗程后血清进行IGF-II,IGFBP-2及IGFBP-3含量检测。结果:1.卵巢肿瘤患者血清IGF-II(pro-, big-, mIGF-II)测定卵巢癌患者血清proIGF-II, big IGF-II和mIGF-II含量均明显下降,与正常对照组,良性肿瘤及交界性肿瘤患者血清相比均有显著性差异(P<0.01或P<0.001)2.卵巢肿瘤患者血清IGFBP-2和IGFBP-3测定卵巢癌患者血清IGFBP-2水平明显升高,与正常对照组、良性以及交界性卵巢肿瘤患者血清相比有显著性差异(P<0.001);而血清IGFBP-3含量明显降低甚至消失,与正常对照组、良性肿瘤以及交界性肿瘤组相比均有显著性差异(P<0.001);正常对照组与交界性肿瘤组亦有显著性差异(P<0.05)。3. IGF-II以及IGFBP-2/IGFBP-3与卵巢肿瘤分期、病理分类的相关性IGF-II各肽以及IGFBP-2,IGFBP-3含量在良性浆液性和粘液性肿瘤组中无统计学差异(P>0.05);在恶性浆液性和粘液性组中亦无统计学差异(P>0.05);在早期和晚期患者间也无统计学差异(P>0.05)。4.卵巢癌患者血清IGF-II以及IGFBP-2,IGFBP-3水平与CA125相关性卵巢癌患者术前血清CA125值与血清IGFBP-2值存在正相关性(P<0.0001);与IGFBP-3值存在负相关性(P<0.0001);卵巢癌患者术前血清CA125值分别与IGF-II各不同肽存在负相关性: proIGF-II(P<0.0001); big IGF-II (P<0.0001); mIGF-II (P<0.0001)。5.卵巢癌患者术前、术后及化疗后血清IGF-II及IGFBP-2,IGFBP-3含量的变化卵巢癌患者血清IGF-II(pro-, big-和mIGF-II)多数于术后1周左右恢复至正常水平;术后1周IGFBP-2水平较术前稍升高或不变,IGFBP-3继续降低或无明显改变,但经过化疗1疗程后,IGFBP-2及IGFBP-3含量均回复至正常水平。6.卵巢癌患者及妇科其他良性疾病患者血清IGF-II以及IGFBP-2,IGFBP-3水平的相关性卵巢癌患者血清IGF-II(pro-, big-和mIGF-II)水平均明显低于其他妇科良性疾病患者,经统计学处理有显著性差异(P<0.001),而妇科良性疾病组与正常对照组相比均无统计学差异(P>0.05);卵巢癌组血清IGFBP-2水平明显高于妇科良性疾病组(P<0.001),妇科良性疾病组与正常对照组相比无统计学差异(P>0.05);卵巢癌组血清IGFBP-3水平明显低于妇科良性疾病组(P<0.001),而妇科良性疾病组与正常对照组间无显著性差异(P>0.05)。7.卵巢癌及妇科其他恶性肿瘤患者血清IGF-II以及IGFBP-2,IGFBP-3水平的相关性妇科其他恶性肿瘤组,约80%的患者血清IGF-II(pro-, big-和mIGF-II)水平高于卵巢癌组, IGFBP-2,IGFBP-3水平变化与卵巢癌相似,但IGFBP-2明显升高且同时伴有IGFBP-3明显降低的发生率低于卵巢癌组。结论:1.卵巢癌患者血清中IGFBP-2水平明显升高,可能与瘤负荷有关,而IGFBP-3水平的明显降低则可能有助于肿瘤生长;2.卵巢癌患者血清中IGF-I(I包括pro-, big-和mIGF-II)水平均显著降低,可能标志着IGF-II生物学活性的改变;3.卵巢癌患者术后及化疗后血清pro-, big-和mIGF-II以及IGFBP-2,IGFBP-3相继恢复至正常水平,提示联合检测血清IGF-II各肽以及IGFBP-2和IGFBP-3含量有助于判断卵巢癌患者的治疗效果。4. IGF-II各肽及IGFBP-2,IGFBP-3水平与CA125均有明显的相关性,联合检测上述指标有助于筛查导致CA125升高的一些良性妇科疾病及部分妇科恶性肿瘤,提高卵巢上皮性癌诊断的准确性和特异性。5.本研究应用改良的WLB和WB方法检测从滤纸抽提的卵巢肿瘤患者微量血清中不同IGF-II肽以及IGFBP-2,IGFBP-3蛋白含量,与传统的蛋白检测方法相比具有高度灵敏度,为卵巢癌以及其他疾病大样本筛查以及地区性研究提供了可行性的血清学检测途径。第二部分IGFBP-2及IGFBP-3对卵巢上皮性癌患者IGF-II生物学功能的调节目的:检测卵巢癌患者血清IGFBP-2及IGFBP-3与IGF-II各肽的相关性,研究IGFBP-2和IGFBP -3对IGF-II生物学功能的调节作用。方法:采用免疫沉淀(Immunoprecipitation, IP)方法确定血循环中IGF-II与IGFBP-2及IGFBP-3的结合状况。血清标本分别应用IGFBP-2,IGFBP-3特异性抗体吸附沉淀(IP)后,再分别经WB测定血清中IGF-II各肽的含量,并通过WLB确定血清中特异吸附沉淀的IGFBP-2及IGFBP-3含量,另外,通过应用IGF-II/IGFBP交叉连接复合物测定(Cross-link)方法分别检测卵巢癌患者血清和正常对照者血清中呈结合状态的IGF-IGFBPs。结果:1. IGFBP-2与big IGF-II的结合能力明显低于IGFBP-3。无论在正常对照组和卵巢癌组,血清中big IGF-II均不与IGFBP-2结合。经过IGFBP-2 IP后,可检测到卵巢癌患者血清中升高的IGFBP-2以及与正常血清相比升高的mIGF-II水平;经过IGFBP-3 IP后,与正常对照组相比,卵巢癌患者血清IGFBP-3明显减少或消失,但可见升高的IGFBP-3降解片段,而big/m IGF-II均减少。2.当bigIGF-II含量明显高于mIGF-II时,可与IGFBP-2结合。与正常血清相比,在卵巢癌患者血清中,bigIGF-II和mIGF-II水平均低于正常对照者,在低剂量外源性bigIGF-II存在的情况下,随着外源性bigIGF-II含量的增加,可检测到其水平增加,而给予相同浓度外源性bigIGF-II的正常血清虽可检测到较高水平bigIGF-II,但并不随剂量增加而明显改变。与其发生相应改变的是在正常血清中随着外源性bigIGF-II的增加,150kDa复合物含量明显增加;而卵巢癌患者可检测到明显增加的IGFBP-2与bigIGF-II连接物,以及因与IGFBP-2结合消耗而较正常血清体系明显降低的bigIGF-II含量。结论:1.卵巢癌患者血清IGFBP-2,IGFBP-3的改变与IGF-II各肽含量的下降明显相关,IGFBP-3明显降低而IGFBP-2明显升高的状况可改变其与big/m IGF-II的结合状况,进而导致游离IGF-II增加而到达相应靶组织发挥作用并降解。2.本研究结果提示血循环中IGFBP-2和IGFBP-3的改变可导致IGF-II生物学活性增强,揭示IGFBP-2和IGFBP对卵巢癌患者IGF-II生物学功能的调节机制。第三部分IGFBP-2及IGFBP-3在卵巢肿瘤患者组织中的表达及临床意义目的:检测卵巢良性、恶性肿瘤患者组织中IGFBP-2以及IGFBP -3的表达,探讨其与卵巢癌临床病理学特征的相关性,并进一步探讨IGFBP-2及IGFBP-3在卵巢癌发生和发展中可能的作用以及作为卵巢上皮性癌生物学标记的可能性。方法:采用免疫组化染色方法检测卵巢肿瘤组织(卵巢良性肿瘤8例,卵巢交界性肿瘤8例,卵巢癌上皮性癌23例,包括高、中度分化者15例,低度分化者8例)中IGFBP-2和IGFBP-3的表达。同时以4例正常卵巢组织(来自于因其他妇科疾病须行全部或部分卵巢切除的患者,并经病理证实无卵巢组织病变)作为对照。结果:1. IGFBP-2的表达位于细胞质或细胞核,卵巢恶性肿瘤IGFBP-2的表达率明显升高,与正常卵巢组织以及卵巢良性肿瘤相比均有显著性差异(P<0.0001);而正常对照组与卵巢良性肿瘤和交界性肿瘤、卵巢良性肿瘤与交界性肿瘤以及交界性与恶性肿瘤相比均无统计学差异(P>0.05)。2. IGFBP-3表达位于细胞质,虽然卵巢恶性肿瘤IGFBP-3的表达率与正常对照组、卵巢良性肿瘤相比呈降低趋势,但经统计学处理无显著性差异(P>0.05)。3.随着卵巢癌分化程度的降低,IGFBP-2的表达呈增强趋势,但低分化组与高中分化组相比无统计学意义(P>0.05)。4.在卵巢上皮性癌组织中,随着卵巢癌细胞分化程度的降低,IGFBP-3的表达明显降低或呈阴性表达,低分化卵巢癌细胞与高、中分化卵巢癌细胞相比有显著性差异(P<0.05)。结论:本研究中发现卵巢肿瘤组织细胞中IGFBP-2和IGFBP-3的表达不仅与肿瘤的良、恶性有关,而且与卵巢癌细胞的分化程度有一定相关性,说明在组织细胞中IGFBP-2及IGFBP-3的表达与卵巢癌患者的临床病理学特征有关。第四部分IGFBP-3在卵巢癌化疗耐药中的调节作用目的:应用铂类敏感和耐药的卵巢上皮性癌细胞株检测IGFBP-3在卵巢化疗耐药中的作用和调节机制。方法:分别建立IGFBP-3完整段以及1-97N末端质粒cDNA,应用两对铂类敏感和耐药的卵巢上皮性癌细胞株( OV2008/ C13* ,A2780s/A2780cp)经过细胞培养、IGFBP-3转染伴有或不伴有DN-Akt病毒感染,再经过CDDP (0, 2.5, 5, 10μM; 24 h)处理后,检测卵巢癌细胞的凋亡以及相应Caspase-3改变情况。结果:1. CDDP可诱导敏感卵巢癌细胞凋亡,但对耐药卵巢癌细胞的凋亡无影响(p<0.01,P>0.05)。CDDP诱导的卵巢癌细胞的凋亡伴随着IGFBP-3的改变。典型的凋亡细胞表现为细胞变园,萎缩,核浓缩并出现分离形成凋亡小体。2.过度表达IGFBP-3可以增强敏感性卵巢癌细胞对顺铂(10μM)诱导的凋亡,与对照组相比有显著性差异(p<0.05);过度表达IGFBP-3虽然可诱导部分耐药卵巢癌细胞对顺铂介导的凋亡,但与对照组相比无显著性差异(P>0.05)。3.过度表达IGFBP-3,并通过DN-Akt病毒感染耐药卵巢癌细胞阻止Akt功能后,可启动并增强CDDP诱导的细胞凋亡。4.过度表达IGFBP-3以及DN-Akt病毒感染介导的卵巢癌细胞的凋亡与激活Caspase-3相关。结论:1. CDDP诱导的卵巢癌细胞的凋亡与IGFBP-3有一定相关性。2.过度表达IGFBP-3可增加CDDP诱导的细胞凋亡,且与DN-Akt病毒感染有协同作用,提示IGFBP-3对卵巢癌细胞的凋亡诱导作用可能与下调Akt介导的细胞信号传导通路有关。