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天然免疫(又称先天免疫或固有免疫)反应是宿主抵抗病原微生物入侵的第一道防线。宿主细胞在受到病毒感染后,细胞内的模式识别受体(pathogen recognition receptors, PRRs)识别病毒的病原相关分子模式(pathogen-associated molecular patterns, PAMPs),激活下游一系列信号转导事件,从而诱导I型干扰素、炎症因子以及下游抗病毒效应蛋白的表达。这些下游细胞因子和效应蛋白可以抑制病毒的复制,清除被感染的细胞,促进适应性免疫应答的发生。精准的亚细胞定位对信号通路分子有效地发挥功能起着重要的作用,尤其是对于转录因子来说,蛋白质的核质转运至关重要。干扰素调节因子3 (Interferon Regulatory Factor 3，IRF3)是病毒诱导I型干扰素表达通路中的关键转录因子,在宿主抗病毒天然免疫应答中扮演重要角色。病毒感染细胞后,会引起IRF3的C端磷酸化、二聚化,进而进入细胞核,与共激活因子CBP/p300形成复合物后结合到IFN-p基因的PRD (positive regulatory domain)区域或者是其他目的基因的 ISRE (interferon-stimulated response element)序列上,从而诱导I型干扰素以及下游抗病毒效应蛋白的表达。IRF3在抗病毒天然免疫反应中的作用依赖于其进入细胞核中发挥转录活性,因此,IRF3的入核转运在IRF3的抗病毒功能中起着关键的作用。小分子蛋白可以自由穿梭核孔复合物,但大分子蛋白(大于40 KD)的核质转运需要转运受体及载体分子来介导其通过核孔复合物。货物蛋白被受体识别需要位于其表面的一段氨基酸序列,被称为核定位信号(Nuclear Localization Signal, NLS)或出核信号(Nuclear Export Signal, NES)。经典的NLS分为单簇碱性氨基酸NLS (monopartite NLS)和双簇碱性氨基酸残基NLS (bipartite NLS)o IRF家族一共有9个成员,过去对IRF家族蛋白的细胞亚定位已经有很多研究,并且大多数IRF家族成员的NLS都已得到鉴定,但I型干扰素诱导通路关键转录因子IRF3的NLS本质及入核调控机制仍然不够清楚。在本项研究中,我们发现IRF3包含一个既控制DNA结合能力又负责入核转运的双元件核定位信号。首先,我们通过截短突变IRF3,并与绿色荧光蛋白融合表达,发现在IRF3的DNA结合区域及毗邻区域(氨基酸序列64～130)存在一段控制入核信号的序列。进一步对该区域的碱性氨基酸进行点突变,我们鉴定出了负责IRF3入核转运的两段关键碱性氨基酸簇。IRF3的双元件核定位信号包含两处碱性氨基酸簇,77KR78和86RK87,分别对应Importin-α的次要结合位点和主要结合位点。突变77KR78会严重抑制IRF3的入核能力,而突变86RK87则让IRF3彻底失去入核能力。免疫荧光实验进一步证实了我们的结论。我们进一步发现,IRF3的双元件核定位信号对其DNA结合活性也很关键,这说明IRF3的入核信号区和DNA识别结合区是整合在一起的,这与其他的干扰素调节因子不同。最后,通过病毒感染和干扰素生物活性实验,我们证明IRF3的NLS区域对于IRF3介导的干扰素的产生和抗病毒免疫应答是必需的。总之,我们的研究揭示了以前从未发现的存在于IRF3上的双元件核定位信号,这一核定位信号不仅具有细胞核转运的功能,还能控制IRF3的DNA结合活性,这对阐明IRF3功能的调节和IRF3介导的抗病毒反应机制具有重要意义。