背景宫颈癌(cervical cancer,CC)为一类发生于妇女阴道以及子宫颈管的一类恶性肿瘤,其发病率在所有妇女恶性肿瘤中排名第二位,因此是严重危害广大妇女生命健康安全的恶性肿瘤之一。在我国,宫颈癌已经成为最常见和多发的妇科恶性肿瘤之一,其死亡率居于我国妇女肿瘤死亡率的第二位,因此我国宫颈癌的发病率在世界范围内依然处于较高水平。自上世纪初开始,外科手术治疗宫颈癌一直沿用至今,为宫颈癌治疗的主要手段,而在目前的临床宫颈癌治疗途径中,单纯子宫全切根治或者联合放、化疗等方法为宫颈癌患者的治疗提供了更多的选择,但在宫颈癌的实际诊断和治疗中,大部分患者在去医院就诊时已为宫颈癌晚期,因此放疗成为了该类患者的主要治疗方法之一。尽管目前临床上采用外科手术或者联合放化疗等方法治疗早期宫颈癌效果显著,但对于中晚期宫颈癌患者却收效甚微。除此之外,抑制宫颈癌细胞生长、增殖、侵袭以及转移的药物均为传统抗癌药,其在杀伤肿瘤细胞的同时亦会对周围正常组织细胞造成毒副作用,且无法避免。.中药在治疗宫颈癌方面具有显著优势,国内外大量基础和临床研究均证实中药能够经由多途径、多靶点、多环节发挥作用,具有综合起效的特点,从而发挥预防和治疗肿瘤的功效。目前,天然植物及其有效成分的抗肿瘤活性已经初步得到国际医学界所认可。大黄素甲醚-8-O-β葡萄糖(physcion8-O-β-glucopyranoside,PG)为羊蹄跟含有的化学成分之一,目前的研究已经证实PG具有抗肿瘤作用,但目前尚未有关于其在体内或体外影响宫颈癌发生和发展的研究。目的本研究通过体外和体内实验两方面对大黄素甲醚-8-O-β葡萄糖苷(physcion 8-O-β-glucopyranoside,PG)对宫颈癌生物学行为的影响进行研究。我们首先通过体外实验观察PG对宫颈癌HeLa细胞增殖的抑制作用,同时研究其能否诱导HeLa细胞凋亡,检测PG作用后凋亡相关蛋白的表达情况,从而明确PG对宫颈癌细胞生物学行为的影响。同时通过建立人宫颈癌细胞裸鼠皮下移植瘤模型,用以研究PG对HeLa细胞裸鼠移植瘤生长的抑制作用,从而进一步明确PG的体内抗肿瘤作用。本研究旨在明确PG抗宫颈癌的作用机制,从而为其应用于临床抗宫颈癌治疗提供实验依据。方法(1)将HeLa细胞随机分为7个药物终浓度组,向每组细胞中加入对应浓度的PG使之终浓度分别为5、10、20、40、60、80、100 μg/mL,进行相应处理24h后用CCK-8法检测细胞增殖抑制率;用40 μg/mL作用于HeLa细胞,分别于0、12、24、36、48、72 h后终止培养,CCK-8法检测各时间点细胞增殖抑制率。将HeLa细胞随机分为对照组和20、40、60 μ g/mL PG组,进行相应处理24 h用DAPI染色实验检测细胞凋亡;Transwe Ⅱ小室法检测细胞侵袭细胞侵袭活性;细胞划痕实验检测细胞迁移能力;流式细胞术检测细胞凋亡情况;western blot法检测caspase-3、caspase-9、Bax、Bcl-2蛋白的表达水平。(2)采用HeLa细胞经皮下注射构建裸鼠移植瘤模型,选取20只已成功构建的皮下移植瘤裸鼠模型,将之随机分为对照组、10、20、40 mg/kg PG组,进行相应处理后观察裸鼠日常情况;在给药后第0、5、8、12、15天时运用游标卡尺对各组裸鼠移植瘤的长度(L)和宽度(W),计算肿瘤体积,绘制移植瘤生长曲线;称取肿瘤重量,计算抑瘤率;免疫组化法检测各组裸鼠移植瘤中caspase-3和Bcl-2蛋白的表达;TUNEL实验检测移植瘤细胞凋亡情况,计算细胞凋亡率。结果(1)当 PG 浓度分别为 5、10、20、40、60、80、100 μg/mmL 时,HeLa 细胞增殖的抑制率分别为(4.3±0.4)%、(18.8±1.7)%、(39.1±3.3)%、(42.2±4.2)%、(60.3±6.5)%、(63.5±6.8)%、(66.4±6.6)%,IC50 为 41.34 μg/mL。用 40 μg/m 作用于 HeLa 细胞,分别于 0、12、24、36、48、72 h后终止培养,CCK-8法检测各时间点细胞增殖抑制率。结果表明,PG作用后0、12、24、36、48、72 h时细胞增殖抑制率分别为0、(36.4±7.8)%、(48.1±7.4)%、(63.3土6.4)%、(72.7±8.6)%。随着PG作用浓度的升高,人宫颈癌HeLa细胞的增殖抑制率也随之增高,随着PG作用时间的延长,HeLa细胞的增殖抑制也随着上升。DAPI染色法检测结果表明,在对照组中几乎未见凋亡细胞,当分别采用20、40、60 μg/mL的PG细胞后,凋亡细胞数量逐渐增多,表现出典型的凋亡形态学特征,显微镜下可见染色质浓缩、细胞膜起泡,同时还能观察到核固缩等。随着PG作用浓度的增高,凋亡细胞数量逐渐增多。对照组、20、40、60 μg/mL PG浓度组细胞的凋亡率分别为0、(13.6±3.5)%、(38.4±6.7)%、(59.5±9.6)%,随着PG作用浓度的增加,人宫颈癌HeLa细胞的凋亡率逐渐增高。Transwell小室法检测结果表明,对照组,20、40、60 μ g/mL PG浓度组细胞的侵袭细胞数分别为(147±22)个、(115±17)个、(78±15)个、(52±12)个,各PG浓度组的侵袭细胞数均明显低于对照组(P<0.05)。上述结果表明,随着PG作用浓度的增加,人宫颈癌HeLa细胞的侵袭细胞数逐渐降低。细胞划痕实验检测结果表明,对照组、20、40、60 μg/mLPG浓度组细胞的迁移距离分别为(365.7±49.5)μm、(288.6±37.3)μm、(231.4±34.6)μm、(156.5±27.9)μm,各PG浓度组的细胞的迁移距离均明显低于对照组(P<0.05),且随着PG作用浓度的增高,HeLa细胞的迁移距离逐渐减小。流式细胞术检测结果表明,对照组、20、40、60 μ g/mL PG浓度组细胞的凋亡率分别为(0.4±0.1)%、(12.3±2.9)%、(36.7±7.1)%、(61.3±8.3)%,各PG 浓度组的细胞凋亡率均明显高于对照组(P<0.05),随着PG作用浓度的增加,人宫颈癌HeLa细胞的凋亡率逐渐增高。Western blot法检测结果表明,对照组、20 μ g/mL PG 组、40 μ g/mL PG 组和 80 μ g/mL PG 组中Bax蛋白的相对表达量分别为(0.08±0.02)、(0.11±0.06)、(0.38±0.15)、(0.74±0.22),各PG浓度组的细胞中Bax蛋白的表达均明显高于对照组(P<0.05),且随着PG作用浓度的增高,Bax蛋白的表达也随之上升;对各组细胞中Bcl-2蛋白的表达量进行检测,对照组、20 μg/mL PG组、40 μ g/mL PG组和80 μ g/mL PG组中Bax蛋白的相对表达量分别为(0.67±0.22)、(0.41±0.19)、(0.28±0.11)、(0.05±0.02),各PG浓度组的细胞中Bcl-2蛋白的表达均明显低于对照组(P<0.05),且随着PG作用浓度的增高,Bcl-2蛋白的表达水平逐渐降低;对各组细胞中Caspase-3蛋白的表达量进行检测,对照组、20 μ g/mL PG组、40 μg/mLPG组和80 μg/mLPG组中Caspase-3蛋白的相对表达量分别为(0.04±0.01)、(0.13±0.05)、(0,28±0.11)、(0.64±0.27),各PG浓度组的细胞中Caspase-3蛋白的表达均明显高于对照组(P<0.05),且随着PG作用浓度的增高,Caspase-9蛋白的表达也随之上升;对各组细胞中Caspase-9蛋白的表达量进行检测,对照组、20 μg/mL PG 组、40 μg/mL PG 组和 80 μg/mL PG 组中 Caspase-3 蛋白的相对表达量分别为(0.08±0.01)、(0.12±0.05)、(0.18±0.09)、(0.31±0.11),各PG浓度组的细胞中Caspase-9蛋白的表达均明显高于对照组(P<0.05),且随着PG作用浓度的增高,Caspase-9蛋白的表达也随之上升。(2)本实验中20只裸鼠均全部成瘤。移植瘤大小测量结果表明,各时间点PG作用组裸鼠的瘤体体积均明显小于对照组(P<0.05);随着PG浓度的增高,裸鼠瘤体体积逐渐减小(P<0.05)。TUNEL检测结果表明,与对照组相比,各PG浓度组阳性细胞数量明显减少(P<0.05);随着PG作用浓度的增高,阳性细胞数逐渐降低(P<0.05)。免疫组化检测结果表明,Caspase-3蛋白染色的阳性部位主要分布于裸鼠移植瘤细胞的包浆,呈棕黄色颗粒状。与0 mg/kg组相比,各PG浓度组裸鼠移植瘤细胞中Caspase-3蛋白的表达水平均明显增高,差异具有统计学意义(P<0.05);随着PG作用浓度的增高,裸鼠移植瘤细胞中Caspase-3蛋白的表达水平亦随之增高。组间两两比较结果表明,10 mg/kg组与20 mg/kg组之间(x2=4.319,P=0.036),10 mg/kg 组与 40 mg/kg 组之间(x2=5.211,P=0.008),20 mg/kg组与40 mg/kg组之间(x2=8.419,P=0.003)Caspase-3蛋白的表达水平均存在明显差异(P<0.05)。Bcl-2蛋白染色的阳性部位主要分布于裸鼠移植瘤细胞的包浆,呈棕黄色颗粒状。与0 mg/kg组相比,各PG浓度组裸鼠移植瘤细胞中Bcl-2蛋白的表达水平均明显减少(P<0.05);随着PG作用浓度的增高,裸鼠移植瘤细胞中Bcl-2蛋白的表达水平亦随之减少。组间两两比较结果表明,10 mg/kg组与20 mg/kg组之间(x2=5.233,P=0.031),10 mg/kg 组与 40 mg/kg 组之间(x2=6.719,P=0.006),20 mg/kg组与40 mg/kg组之间(x2=9.822,P=0.002)Bcl-2蛋白的表达水平均存在明显差异(P<0.05)。结论PG能够在体内外抑制宫颈癌Hela细胞和移植瘤生长,促进其凋亡,其作用机制与抑制Bcl-2表达,促进caspase-3、caspase-9、Bax表达有关。